微生物学的复制和修复

微生物学的复制和修复第一页，共五十四页，2022年，8月28日第一节DNA的复制(DNAreplication)

DNA复制的几个原则：1.半保留复制(Semiconservative)

DNA复制时，双螺旋结构解开而成两股单链，各自作为模板，合成新的互补链。子代细胞出现的DNA双链，其中一条单链是从亲代完整地接受过来，另一条单链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。1958年，M.Meselson和F.W.Stahl用同位素标记和密度梯度离心的方法首次证明了这种复制机制。

第二页，共五十四页，2022年，8月28日

TheMeselson-StahlexperimentwasdesignedtodistinguishbetweentwoalternativeDNAreplicationmechanisms.第三页，共五十四页，2022年，8月28日

1963年，Cairns用放射自显影的方法，第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌的DNA，证明大肠杆菌的DNA是一个环状分子，以半保留的方式进行复制。ACB第四页，共五十四页，2022年，8月28日DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制后，DNA的结构仍然可以保持完整，这与它的遗传功能是相符的。

2.DNA复制有固定的起点，而且通常是双向复制

原核生物的DNA和质粒DNA属于环状双链DNA，具有一个固定的复制起点，从该起点开始，双向等速度地复制。复制过程中，在电镜下可以看到一个形如眼睛的结构，称为复制眼，它类似于希腊字母θ，所以这种复制方式又称为θ复制。

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ReplicationofacircularchromosomeproducesastructureresemblingtheGreeklettertheta(θ),andshowsthatbothstrandsarereplicatedatthesametime.第六页，共五十四页，2022年，8月28日

Additionof[3H]thymidineforashortperiodjustbeforethereactionisstoppedallowsadistinctiontobemadebetweenunidirectionalandbidirectionalreplication.第七页，共五十四页，2022年，8月28日

真核生物的DNA是线状双链DNA，有多个复制起点，在每个复制起点上双向、等速度地进行复制。第八页，共五十四页，2022年，8月28日

3.DNA复制的方向为5’→3’，是半不连续的子链DNA的复制方向都是5’→3’，所以母链的读链方向是3’→5’。(前导链)(后续链)(冈崎片段)第九页，共五十四页，2022年，8月28日一、DNA的聚合反应

从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶Ⅰ，能在具备

底物：4种dNTP

模板：一条单链DNA

引物：一小段与模板配对的DNA或RNA，具备3′-OH

Mg2+

的条件下，使4种dNTP聚合起来。新加上的dNTP与引物的3′-OH作用，形成3′,5′-磷酸二酯键，且所加上的核苷酸要与模板上的碱基互补配对，合成方向是从5′→3′。第十页，共五十四页，2022年，8月28日

DNA聚合酶催化DNA链的延长DNA聚合酶第十一页，共五十四页，2022年，8月28日

二、与DNA聚合有关的酶

⒈DNA聚合酶

⑴原核生物DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)由大肠杆菌的polA基因编码的一条多肽链，分子量为109KD，每个大肠杆菌中约有400个PolⅠ分子，它催化脱氧核苷酸聚合的速度为1000个/分。PolⅠ具有的功能：⑴按5′→3′方向延长核苷酸链的功能；⑵3′→5′外切酶的功能；⑶5′→3′外切酶的功能；该外切酶功能的特点是切去的核苷酸是正确配对的，这种功能在DNA的复制中引物的切除及DNA损伤的修复中起着重要作用。

第十二页，共五十四页，2022年，8月28日正常的碱基互补配对由于互变异构等导致的不正常配对第十三页，共五十四页，2022年，8月28日DNA聚合酶Ⅰ的3→5外切酶的校对作用′′第十四页，共五十四页，2022年，8月28日DNA的5′→3′外切酶功能可以切除一段与模板配对的DNA或RNA链，同时又可以合成一段新的DNA单链，表现为“切口位移”。第十五页，共五十四页，2022年，8月28日用枯草杆菌蛋白酶将PolⅠ水解成大、小两个片段，大片段有聚合酶和3′→5′外切酶的功能，又称为Klenow片段。DNA聚合酶Ⅰ的空间构型第十六页，共五十四页，2022年，8月28日

DNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)也需要模板、引物、底物和Mg2+，合成方向也是5′→3′,也具有3′→5′外切酶功能，但没有5′→3′外切酶功能。它只在无PolⅠ和PolⅢ的时候才发挥聚合酶作用,每个大肠杆菌中有约40个酶分子。

DNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)在大肠杆菌中的量只有PolⅠ的1/20，但活性比PolⅠ高40倍以上，每分钟能催化105个核苷酸的聚合，是大肠杆菌中真正负责合成DNA的聚合酶，由多种亚基组成。第十七页，共五十四页，2022年，8月28日

E.coli中三种DNA聚合酶的比较第十八页，共五十四页，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲ的亚基组成及主要功能第十九页，共五十四页，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲβ-亚基形成环状结构围绕着DNA双链。第二十页，共五十四页，2022年，8月28日

⑵真核生物的DNA聚合酶

真核生物中发现的DNA聚合酶有α、β、γ、δ四种。α-DNA聚合酶的活性与DNA合成的活跃程度有时相的相关，负责真核生物DNA中后随链的合成；β-DNA聚合酶存在于细胞核，最适pH为碱性，有最强的外切酶活性，被认为与损伤的修复有关。γ-DNA聚合酶存在于线粒体，参与线粒体DNA的复制。δ-DNA聚合酶是多亚基酶，有3′→5′外切酶活性，负责真核生物DNA中前导链的合成。第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日

复制的保真性

DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对，使遗传信息延续、传代的保证。要确保DNA复制的保真性，至少依赖三种机理：⒈遵守严格的碱基配对规律；⒉聚合酶在复制延长中对碱基的选择作用；⒊复制中出错时有及时的校对功能。第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日

⒉DNA连接酶(ligase)

因为DNA聚合酶不能将3′-OH和5′-PO32-连接起来，所以不能形成闭合、连续的子链。

DNA连接酶是能催化一条DNA链的3′-OH和另一条DNA链的5′-PO32-之间形成磷酸二酯键的酶，但连接的都是碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的能力，也没有连接超过两个碱基以上的缺口的能力。

第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日常用的DNA连接酶有两种：⑴大肠杆菌的DNA连接酶：能催化粘性末端的连接；⑵T4DNA连接酶：既能催化粘接，也能催化平头连接；

连接反应的能量来源：①细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源；②动物细胞和噬菌体的DNA连接酶以ATP为能量来源；第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日DNA连接酶的作用机理第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日

⒊DNA引物酶(primase）因为DNA聚合酶不能起始合成新的DNA链，所以需要合成一段引物提供3′-OH。催化RNA引物形成的酶就是RNA引物酶，本质上属于以DNA为模板的RNA聚合酶，但与催化转录的RNA聚合酶有本质的不同：引物酶在模板的起始部位催化互补碱基的聚合，形成10-60个核苷酸长的RNA的引物片段。第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日

⒋DNA解螺旋酶(helicase)

DNA在复制之前，须先排除核苷酸之间的氢键作用和疏水性基团的相互作用，将双链解开，DNA解螺旋酶就是一类通过水解ATP获得能量，在复制叉处解开DNA双链的酶。每解开一对双键，要消耗2个ATP的2个高能键。

DNA解螺旋酶首先同DNA的单链部分结合，再按复制叉移动方向向双链部分延伸，DNAhelicase和Rep蛋白(解螺旋酶的一种)协同作用，前者结合在滞后链的模板上(即在方向5′→3′母链上随复制叉方向移动)，后者结合在前导链的模板上。

第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日

⒌DNA单链结合蛋白(DNASSB)

DNA解螺旋酶解开的双链由DNA单链结合蛋白来稳定，DNASSB的特性就是能专一性地同DNA分子中已解开的单链区结合，阻止复性和DNA被核酸酶降解。SSB同DNA结合时表现出协同效应。第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日

⒍DNA拓扑异构酶Ⅰ(topisomeraseⅠ)

DNA拓扑异构酶Ⅰ可以将共价闭环的超螺旋DNA解开成松弛态的闭合环状DNA，反应机理是先切开双链DNA的一条链，使链的末端螺旋向拧松超螺旋的方向转动，然后再将切口连接起来，所以兼有水解酶和连接酶的功能。每作用一次，使负超螺旋数目+1。

第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日⒎DNA拓扑异构酶Ⅱ(topisomeraseⅡ)

与DNA拓扑异构酶Ⅰ相反，DNA拓扑异构酶Ⅱ能在DNA中引入负超螺旋，作用机理是在ATP提供能量下，水解切断DNA的两条链，两条链的断口同时饶过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。每作用一次可使超螺旋数目－2。第三十页，共五十四页，2022年，8月28日

三种能催化形成磷酸二酯键的酶的比较

提供3′-OH提供5′-P结果

DNA聚合酶引物或延长中的新链游离的dNTP形成(dNMP)n+1DNA连接酶复制中不连续的两条单链形成连续的链DNA拓扑酶切断并整理后的单链或双链改变拓扑状态第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日

三、DNA的复制过程

E.coli复制的起始位点(oriC)第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日

要开始复制，至少需要以下的蛋白质因子：

DnaA蛋白：识别oriC，在特定部位解开双链

DnaB蛋白：即解螺旋酶

DnaC蛋白：帮助DnaB在起始位点的结合

HU:类似组蛋白的蛋白质，启动复制的起始引物酶：合成RNA引物

SSB：结合单链DNADNA拓扑异构酶：释放DNA解链产生的超螺旋1.复制的起始第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日E.中DNA复制的起始coli在解链酶、SSB和拓扑酶等酶及蛋白质因子的共同作用下，DNA双链解开成单链。第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日

⒉复制的延长延长阶段同样需要解螺旋酶和拓扑异构酶解开双链，需要SSB稳定DNA单链，但前导链和滞后链的复制是完全不同的。前导链的复制，可以由5′→3′方向，在引物上连续进行，直至复制终点。第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日在滞后链上，要先由引物酶分段合成RNA引物，在各段引物上按5′→3′方向分别形成DNA片段(即冈崎片段)至前一个冈崎片段的前方为止。引物酶和其他蛋白质因子共同组成引发体。第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日前导链和滞后链的合成实际上是由DNA聚合酶Ⅲ二聚体催化同时完成的。第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日E.coliDNA聚合酶Ⅲ二聚体的作用机理第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日

⒊复制的终止

DNA聚合酶Ⅰ利用其5′→3′核酸外切酶的活性，将冈崎片段的RNA引物水解，产生的空隙由后面的冈崎片段继续延伸填补，这个过程也由DNA聚合酶Ⅰ来完成，延长直至前一个片段的5′-P，最后由DNA连接酶将片段之间所剩的小缺口通过形成磷酸二酯键连接起来，成为真正连续的子链。第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日

第二节DNA的损伤与修复

DNA的突变和保守是对立统一的自然现象，没有突变，就没有今天多种多样的物种。

㈠突变的分子基础突变就是DNA分子上碱基的改变，分为自发突变和诱发突变。突变的后果有以下四种：①致死性的；②使生物体功能丧失；③只改变基因型而无表现型的改变；④有益的突变。第四十页，共五十四页，2022年，8月28日

根据DNA分子的改变，可把突变分为①点突变DNA分子上一个碱基的变换，又分为转换（同型碱基的相互替换）和颠换（异型碱基的相互替换）；②缺失一个碱基或一段核苷酸链从DNA分子上消失；③插入一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA分子中间；缺失和插入可以引起移码突变，④倒位DNA链内部重组，使其中一段方向反置，或大片段的链在DNA分子内迁移。第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日

诱发突变的原因及突变类型诱变因素突变类型物理因素紫外线照射形成胸腺嘧啶二聚体离子辐射打断DNA分子的共价键化学因素5-溴尿嘧啶使A-T对最终变成G-C对羟胺使G-C对最终变成A-T对亚硝酸盐使G-C对最终变成A-T对氮芥类使DNA链脱鸟嘌呤第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日复制甲基化的G使DNA发生G-C→A-T的突变第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日

二、损伤的修复

㈠光修复

紫外线引起相邻嘧啶碱基之间形成二聚体。第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日光复活酶修复嘧啶二聚体第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日

㈡切除修