第六章酶与细胞固定

第六章酶与细胞固定化直接应用酶的不足之处:(1)酶的稳定性差;在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活(2)酶的一次性使用；酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产(3)产物分离困难；酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难发展历史1953年,德国,Grubhofer、Schleith,聚氨基苯乙烯树脂为载体，重氮法;1969年，日本，千烟一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出;1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统一英文名称为ImmobilizedEnzyme。1973年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。1976法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精；1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶，1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功；1982年日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。(1)固定化酶(2)固定化菌体(死细胞)(3)固定化活细胞(增殖细胞)(4)固定化原生质体(5)固定化动植物细胞种类优点(1)提高酶稳定性；(2)可反复或连续使用,成本降低;(3)易于和反应产物分开,简化提纯工艺;（4）酶反应过程可严格控制；（5）较游离酶更适合多酶反应；（6）增加产物收率，提高产物质量；缺点（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；第一节酶固定化定义酶的固定化:将酶或菌体与不溶性载体结合的过程;固定化酶:固定在载体上并在一定空间内进行催化反应的酶。概念发展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”固定化酶制备原则（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；载体要有一定的机械强度，以免搅拌而破碎。（3）应有最小的空间位阻；尽可能不妨碍酶与底物接近（4）酶与载体必须结合牢固；以便回收重复使用（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。1、吸附法(link)2、包埋法(link)3、结合法(link)4、交联法(link)5、热处理法(link)一、酶固定化方法go1、吸附法

用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法;

固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.(3)既能吸附酶也能吸附其它物质，因此吸附的选择性差。back2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等(1)凝胶包埋法（网格包埋法）天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶强度高，对温度、pH值变化的耐受性强。但因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性：适用固定化微生物；不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化(2)半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性：底物和产物都是小分子物质的酶微胶囊直径一般只有几微米至几百微米?微型胶囊法微胶囊型固定化酶制备酶+亲水性单体溶于水疏水性单体溶于有机溶液混合乳化剂乳化酶液分散成小水滴亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋Tween-20破乳离心半透膜酶液滴（3）胶格包埋法首先被采用的胶格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂－－inactiationback3、结合法选择适宜的载体,通过共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法酶载体(1)离子键结合法载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;条件温和，操作简便，活力损失少；结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落(2)共价键结合法是载体结合法中报道最多的方法;载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;也可分三类:天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性载体活化方法1、重氮法;2、迭氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一活泼基团，该基团能与酶分子上某一基团反应。重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团迭氮法含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物溴化氰法含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物烷基化法含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体back4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构特点此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体双功能试剂戊二醛、己二胺、双偶氮苯等第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶酶双功能剂戊二醛:(p.163）优点结合牢固，可以长时间使用缺点因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用图7－11酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶5、热处理在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内适用性：热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间back酶固定化方法示意图固定化酶方法的优缺点比较评估指标判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性,常见的评估指标有以下几条:

(1)相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力.＝固定化酶活力/（总酶活力－未结合的酶活力）它与载体的结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关．相对酶活力低于75%的固定化酶,一般没有实际应用价值．

（2）酶结合效率（偶联率）＝（总酶活力－未结合的酶活力)/总酶活力＝（总酶蛋白－未结合的酶蛋白）/总酶蛋白偶联率＝1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率＜1时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率＞1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。(3)酶活力回收率：固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力的百分比称为酶的活力回收率。

＝固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果．一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果．(4)固定化酶的半衰期即固定化酶的活力下降到为初始活力一半所经历的时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键．其测定方法可以通过长期实际操作,也可以通过较短时间的操作来推算．1、稳定性(link)2、最适温度(link)3、最适pH(link)4、底物特异性(link)

go二、固定化酶的性质1、稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度A固定化酶B游离酶稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.(back)2、最适温度与游离酶差不多A固定化酶B游离酶最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10℃;以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15℃汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为80℃，比固定化前提高了30℃。同一种酶，用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度(back)3、最适pH值酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微环境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH值的影响酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低中性:固定化酶的最适pH值一般不变原因:载体障碍产物的扩散(back)4、底物的特异性与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用(back)三、固定化酶的应用1、工业生产(link)2、酶传感器(link)3、药物控释载体（link)go1、固定化酶在工业生产中的应用(1)氨基酰化酶Aminoacylase首例，1969年，日本田边制药公司，DEAE-葡聚糖凝胶固定化酶,拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-aa，成本降低40%左右。DL-乙酰—AlaL—Ala+乙酸泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化酶在工业生产中的应用(续)(2)葡萄糖异构酶规模最大。1973年。热处理法，国内外广泛研究和应用。(3)天门冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌体，包埋法，将延胡索酸转化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合法。(4)青霉素酰化酶1973年，催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA),也可催化6-APA或7-ACA+羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素;6-氨基青霉烷酸青霉素头孢霉素固定化酶在工业生产中的应用(续)(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制L-苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌体。1977年，由延胡索酸制L-苹果酸，角叉菜胶包埋法，黄色短杆菌(6)ß-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶(7)天门冬氨酸-ß-脱羧酶1982年，天门冬氨酸生产L-丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋Back２、固定化酶在酶传感器方面的应用酶传感器是由固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管)密切结合而成的传感装置，属于生物传感器的一种酶电极:固定化酶+电极，应用最广泛;用途:临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测go生物传感器用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理、化学传感器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控手段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法;在21世纪生物经济发展中，生物传感技术将是介于信息和生物技术之间的新增长点;中国生物传感器的研究起步于70年代末期。早期研究普遍采取氧电极作生物反应中的换能器,以葡萄糖氧化酶为活性材料一、概述生物传感器(续)早期的血糖速测仪我国第一种实用化的生物传感器---SBA-30型乳酸分析仪维生素C速测仪

生物传感器(续)传感器能将一种被测信号（参量）转换成一种可输出信号的装置。生物传感器(biosensors):用生物成分作为感受器的传感器。由感受器、换能器、电子线器组成二、生物传感器组成和工作原理感知固定化配基与待测物结合产生的微小变化，把这种变化转化为其它可识别信号，其质量好坏决定了传感器的灵敏度。换能器是生物传感器的心脏，整个生物传感器的核心技术也在此。制备分两方面工作，一是选择最佳载体材料（需活化）；二是在载体表面固定化亲和配基（非共价和共价）感受器葡萄糖氧化酶电极1962年Clark和Lyons提出模型1967年Updike和Hicks首先制造聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜强度20~50um基本结构酶膜+多分子膜(聚四氟己烯等)+氧电极图5-1葡萄糖氧化酶电极

感应电极

酶电极示意图ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O２半透膜酶胶层GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。脲电极Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3青霉素酶电极酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝胶(或光交联树脂)电极:pH电极结合:酶膜紧贴在玻璃(pH)电极上反应:青霉素+H2O青霉烷酸+H+青霉素酶表5-1一些常用的酶电极back固定化酶在酶传感器方面的应用(续)图4、SBA-40型谷氨酸葡萄糖双功能分析仪

图5、SBA-50型糖化酶生物传感分析仪SBA-70型生物传感在线血糖乳酸自动分析系统固定化酶在酶传感器方面的应用(续)Back药物控释载体药物应用临床不顺利的原因:蛋白类药物被胃酸破坏被肝和血液中的酶系统清除药物本身毒副作用免疫问题药物稳定性差建立合理的给药体系，核心是从时间和空间分布上控制药物的释放控释体系涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，也称载体药物(1)聚合物修饰(2)凝胶包埋(3)微球制剂(4)脂质体(5)导向药物Back第二节细胞固定化细胞特性比较概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的特点类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞生理状态：活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。最多使用：颗粒状珠体使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。一、细胞固定化方法吸附法包埋法吸附法它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。影响吸附法的主要因素

（1）Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料包埋固定法

包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。

包埋法分类常用载体：琼脂、