微生物限度检查法操作规程

微生物限度检查法操作规程第一页，共四十三页，2022年，8月28日定义微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。第二页，共四十三页，2022年，8月28日本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。第三页，共四十三页，2022年，8月28日检查环境微生物限度检查环境在洁净度C级下的局部洁净度B级的单向流空气区域内进行。第四页，共四十三页，2022年，8月28日微生物限度检查室第五页，共四十三页，2022年，8月28日要求温度：18～26℃；相对湿度：45～65％；压差：洁净室与外界压差≥30Pa第六页，共四十三页，2022年，8月28日培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基第七页，共四十三页，2022年，8月28日稀释液和冲洗液

0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%氯化钠溶液第八页，共四十三页，2022年，8月28日供试品的保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。第九页，共四十三页，2022年，8月28日实验前的准备以头孢氨苄胶囊为例1.在《洁净室使用记录上》登记好头孢氨苄胶囊的规格、批号；准备一张微生物限度检查空白记录，填好除检验结果以及温湿度外的其他必要信息。第十页，共四十三页，2022年，8月28日2.准备好相应的检查用品：营养琼脂培养基和玫瑰红纳琼脂培养基各1瓶融化后，放入烤箱中待用100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1瓶9ml/管的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4支0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶）滤杯沉降菌平皿空白平皿-吸管、镊子、剪刀等放入不锈钢盒中经干热灭菌后待用第十一页，共四十三页，2022年，8月28日3.配置消毒液0.1%洁尔灭溶液75%乙醇第十二页，共四十三页，2022年，8月28日传递窗物料微生物限度检查室注：进入无菌检验室的样品若有两层包装的，需将外包装在传递窗或缓冲间拆除后，经传递窗传入实验室。4.将待检样品以及的相关用品（包括培养基、缓冲液以及检测用器皿等），经传递窗紫外消毒60分钟后，再转运至微生物限度检查室。第十三页，共四十三页，2022年，8月28日5.按空调机组上的"F2”键，开启空调；通过物流通道处的按钮，开启净化工作台。第十四页，共四十三页，2022年，8月28日

化验人员按照《进出微生物检测室更衣操作规程》进行正确的更衣。第十五页，共四十三页，2022年，8月28日进入更鞋室→更鞋→脱去工作服及私人衣物（只剩贴身内衣、内裤）挂在衣钩上→并将所有头发塞入发网中固定→洗手→用手肘开门进入一更。然后取GEL溶液2～3ml，采用六步法对双手和手腕进行消毒（在30秒内保持双手完全被GEL覆盖）→用手肘开门进入C级二更（黄色地面）。第十六页，共四十三页，2022年，8月28日在二更更鞋，然后戴上绸帽，绸帽应包裹住全部头发；再戴上口罩，口罩必须覆盖嘴、鼻，在脑后勒紧；最后穿洁净区连体工作服，依次将左脚、右脚、左手、右手穿入（过程中应避免碰触洁净衣外表面，同时洁净衣也不得接触地面或墙面）→检查自己的着装→用手肘开门进入C级缓冲间。在C级缓冲间，用手肘开门分别进入C级微生物限度检查室一和检查室二，带上无菌手套，再在消毒液中浸泡约30秒。第十七页，共四十三页，2022年，8月28日化验人员用浸泡了消毒液的无菌毛巾，擦拭净化工作台台面。打开传递窗，将相关的检查用品依次摆放在不锈钢桌上和净化工作台上。（镊子和剪刀应插入75%酒精棉球中）第十八页，共四十三页，2022年，8月28日准备7个沉降菌平皿，做好标记和日期在净化工作台上和检查室地面上摆放好沉降菌平皿。用消毒液清洗浸泡双手，将消毒毛巾贴好，放在净化工作台台面上。净化工作台2个检查室地面2个操作者手指1个消毒液1个空白对照1个第十九页，共四十三页，2022年，8月28日供试液的制备原则根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。所用乳化剂，分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间不得超过30min第二十页，共四十三页，2022年，8月28日常用的供试品制备方法液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。固体、半固体或粘稠液供试品称取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10供试液。有必要时可适当加温（不应超过45℃）。第二十一页，共四十三页，2022年，8月28日供试液的制备

取10g头孢氨苄胶囊于磨口瓶中，用无菌剪刀将其剪碎，加入100mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液混匀，作为1：10供试液。静止得上清液备用。

第二十二页，共四十三页，2022年，8月28日在供试液静止沉淀的同时准备8个无菌平皿，每2皿为一组，分别在每组的2个平皿盖上分别依次注明“0（空白）,10-1,10-2,10-3”。准备3瓶胆盐乳糖培养基，分别在瓶上注明”1-/2,1+/2,0/2",其中2标示当月2号，1表示当天所做的第一个样品、+：表示样品阳性，-：表示样品、0：表示阴性对照。第二十三页，共四十三页，2022年，8月28日细菌和控制菌检查薄膜过滤法制备平皿准备2个无菌平皿，倾注营养琼脂培养基约15-20ml，半盖盖，除出去冷凝水后，盖上平皿盖待凝。第二十四页，共四十三页，2022年，8月28日火焰喷射器在检验仪的过滤头表面灭菌3～5秒钟。镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住3张无菌滤膜放置在3个过滤头中央。将已经过灭菌的过滤杯小心安装在过滤头上。从过滤杯的上边缘按下过滤杯卡在过滤头上。在安装滤杯的时候，手不要接触滤杯的内部第二十五页，共四十三页，2022年，8月28日预润滤膜将事先插在75%酒精棉球中的剪刀过火焰数次后，撬去冲洗液瓶子的铝塑盖和胶塞，将瓶口和瓶颈部位过火焰数次。向3个过滤杯中，分别加入少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液，顺时针旋转阀门手柄90度，打开过滤头对应阀门。按下检验仪的启停开关启动仪器过滤。第二十六页，共四十三页，2022年，8月28日过滤样品分别取10ml上清液（取相当于1g供试品），分别加入3个滤杯中过滤或先将10ml上清液加入100ml0.1%无菌蛋白胨水中混匀，再过滤。冲洗用800ml0.1%无菌蛋白胨水分次冲洗过滤，每次约100ml，总冲洗量不得超过1000ml。每次冲洗时冲洗液瓶的瓶口和瓶颈部位应过火焰数次，在过滤前后，应保持滤膜的完整性。第二十七页，共四十三页，2022年，8月28日样品过滤完后，逆时针旋转阀门手柄90度，关闭过滤头对应阀门，然后按启停开关停止仪器。镊子在火焰上灭菌并冷却取出第一张滤膜，菌面朝上贴于制备好的培养基平板上。（滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长）。第二十八页，共四十三页，2022年，8月28日镊子再次火焰上灭菌并冷却分别取出第二张和第三张滤膜，快速接至100ml胆盐乳糖培养基中，分别做为样品和样品阳性。取10mlpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液加入100ml胆盐乳糖培养基中作为阴性对照。第二十九页，共四十三页，2022年，8月28日再用火焰喷射器在灭菌检验仪的过滤头镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住1张无菌滤膜放置在1个过滤头中央。安装过滤杯用少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，过滤。取出滤膜，贴于培养基平板上做为阴性对照。第三十页，共四十三页，2022年，8月28日酵母菌和霉菌的检查平皿法

样品的稀释10-210-110-3每递增l稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体）第三十一页，共四十三页，2022年，8月28日在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该级稀释液各1ml至2个灭菌平皿中，（一般为左手持平皿，将盖半开，右手持吸管），注入平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。第三十二页，共四十三页，2022年，8月28日阴性对照待各级稀释液注皿完毕后，用1支吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入2个平皿中第三十三页，共四十三页，2022年，8月28日右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中玫瑰红琼脂培养基倒入培养皿，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿半盖盖，除出去冷凝水后，盖上平皿盖至操作台上待凝倾注培养基注：混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上第三十四页，共四十三页，2022年，8月28日培养将冷凝后的平板用保鲜膜包裹好，注明检查日期。倒置培养，细菌平板于30～35℃培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板于23～28℃培养箱中培养5天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。第三十五页，共四十三页，2022年，8月28日完成微生物限度检查后，将待培养的样品、废弃物等通过传递窗传出。检查人员对洁净室进行清洁。第三十六页，共四十三页，2022年，8月28日

操作结束后

操作前

每周

每天清洁和消毒频率第三十七页，共四十三页，2022年，8月28日细菌数选取平均菌落数在30—300之间的稀释级。霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30—100之间的稀释级。

因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。菌落报告原则第三十八页，共四十三页，2022年，8月28日菌落计数一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间4～7天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。第三十九页，共四十三页，2022年，8月28日菌落计数若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。第四十页，共四十三页，2022年，8月28日菌落报告原则如只有1个稀释级平均菌落数在30—300（30--100）之间，则将该稀释级的菌落乘以稀释倍数报告。稀释菌落数平均值报告10－1280260270270×10＝270010－2292810－332第四十一页，共四十三页，2022年，8月28日当有2个或2个以上稀释级的菌落数符合上述规定时，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告。第四十二页，共四十三页，2022年，8月28日如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。稀释菌落数