第三章细胞生物学研究方法(6学时)汇总

第三章细胞生物学研究方法

细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物是基于不同物种享有共同分子机制虽然鲸鱼与人类的体型大小差别很大，但是基因却差别不大，有很多同源基因。CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法

1光学显微镜技术（lightmicroscopy）

2

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)3扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)一、光学显微镜技术（lightmicroscopy)

普通复式光学显微镜技术

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差显微镜（phase-contrastmicroscope）普通复式光学显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨率梯度普通光学显微镜样品一般经固定、染色后观察较厚样品切片后观察。普通光学显微镜制片技术荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）FluorescentMicroscopeObjectiveArcLamp(弧光灯)

EmissionFilterExcitationDiaphragm(光圈)Ocular(目镜)Excitation

Filter荧光显微镜光路图荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）应用

直接荧光标记技术

间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术)

FluorescenceMicroscopeimageofHoechststainedcells(plusDIC)Imagecollectedwitha470TOptronicscooledcamera直接荧光标记技术荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）应用

直接荧光标记技术

间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术)

在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：

如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

应用：绿色荧光蛋白激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope普通荧光显微镜激光共聚焦扫描显微镜激光共焦扫描显微系统(Confocal

System)激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通过“光切片”观察样品内部结构，可重构样品的三维结构。PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技术显示的花粉内部结构1为转GFP基因的烟草单细胞；2为转SCaM1-GFP融合基因的烟草单细胞；3为转SCaM4-GFP融合基因的烟草单细胞。

质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察细胞壁细胞膜细胞核细胞壁细胞壁细胞膜细胞核细胞膜细胞核细胞核细胞膜细胞壁细胞核细胞膜荧光能量共振转移（FRET）活体检测生物大分子的相互作用

蛋白质间的相互作用（10nm）受体-供体（CFP-YFP）激发光，发射光钱永健2008年NobelFRET就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10nm）时，将光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）CFP受光激发后便发射光CFP受光激发后但没有发射小光。CFP离YFP的距离大于10nmCFP与YFP非常接近（1-10nm）YFP没有受到激发，因此也不发射光CFP没有受光激发，但发射光2008年诺贝尔化学奖

RogerTsien对GFP的机理作出了贡献。制造了很多GFP突变体。相差显微镜（phase-contrastmicroscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞

微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）

偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）

计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动相差显微技术相差显微镜与微分干涉显微镜的光路比较以及图片示例录像增差显微镜技术图片示例二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

电镜与光镜的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术

主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意细胞超微结构固定

包埋切片染色超薄切片技术超薄切片技术图片示例主要电镜制样技术

负染色技术（Negativestaining）

用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色。衬托出样品的精细结构，如病毒核糖体等结构。

冷冻蚀刻技术（Freezeetching）

冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。

冷冻蚀刻主要电镜制样技术

电镜三维重构技术

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

三维重构技术二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

扫描电镜原理与应用：

电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。

CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题扫描电镜原理与图片示例三、扫描遂道显微镜ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器。(Nobel奖)反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。特点：分辨率高：

侧分辨率：分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm不受介质限制非破坏性

用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。红细胞用扫描隧道显微镜在高定向裂解石墨表面上刻写的汉字“中国”，其中笔画的线条宽度为10nm。用扫描隧道显微镜画出来的中国地图其比例尺为l∶1013。这是目前世界上最小的中国地图。如果用这样大小的汉字来书写《红楼梦》一书，只需大头针针头那样小的面积，就可写进全书的内容。

3.特异蛋白抗原的定位与定性

2.细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类的显示方法

4.细胞内特异核酸的定位与定性

5.放射自显影技术

6.定量化学分析技术

1.离心分离技术第二节细胞组分的分析方法一、离心分离技术

用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离差速离心密度梯度离心;连续密度梯度（等密度沉降）不连续密度梯度（速度沉降）常用的介质：蔗糖、氯化铯、甘油等。

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

FeulgenStaining：DNA

苏丹染色:脂肪和胆固醇

Millon染色：蛋白质

PAS反应：多糖二、细胞内核酸、蛋白质酶、糖与脂类的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限

免疫荧光技术图片示例三、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限免疫电镜技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。

免疫胶体金技术原理与图片示例三、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限免疫电镜技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot)四、细胞内特异核酸的定位与定性

光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记的探针）

电镜水平的原位杂交技术

（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）

五、放射自显影技术原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：放射性前体分子掺入细胞内同位素位置的显示

六．定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法

流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。流式细胞仪原理第三节细胞培养、细胞工程

1细胞的培养2细胞工程与显微操作技术一、细胞的培养

动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primaryculturecell） 传代培养细胞（sub-culturecell） 有限细胞系（cellline）40-50代，染色体正常，接触抑制永生细胞系：染色体改变，接触抑制丧失，无限传代细胞株：从细胞中分离单个细胞，具有特殊遗传标记或性质植物细胞培养非细胞体系（cell-freesystem）

Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养一、细胞的培养

动物细胞培养植物细胞培养

类型：

单倍体细胞培养（花药培养）原生质体培养（体细胞培养）

一、细胞的培养

动物细胞培养植物细胞培养

非细胞体系（cell-fr