稀土荧光探针检测多巴胺及类似物

稀土荧光探针检测

多巴胺及类似物答辩人：袁洁导师：赵美萍副教授2003年6月18日选题背景已有检测方法综述实验部分总结致谢儿茶酚胺的结构

及生理意义儿茶酚胺（catecholamine,CA）的种类、结构和生理意义神经递质在单细胞检测中的意义Dopamine（DA）瑞典神经药理学家Carlsson于1958年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的神经递质

正常值范围为血浆：＜888pmol/L；尿：424-2612nmo1/24h。增高会引起嗜铬细胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低会引起植物神经病变，帕金森病等。

Epinephrine（E）&

norepinephrine（NE）

在人体内的正常值范围为血浆：＜480pmo1/L；尿：0-80nmo1/24h在人体内的正常值范围为血浆：615-3240pmol/L；尿：0-590nmol/24h对儿茶酚胺的检测手段

检测方法灵敏度优点缺点放射酶学法2.2×10-10

M,灵敏度高，选择性好技术难度高，检测速度慢，危险

HPLC法

depends分离效果好，可结合不同检测器应用流动相有可能影响检测效果荧光测定法(THI、EDA)

10–10M-10–9M（改良后）常规使用，改良后灵敏度较高样品处理程序复杂，特异性不高

电化学分析法

10–6M-10–5M能排除抗坏血酸的影响，重现性较好

灵敏度低,只是针对DA检测,仍处于实验研究阶段

毛细管电泳（CE）法

10-8

M（depends）分离高效,耗样量少

灵敏度尚不高稀土荧光探针法10-8

M简便，可以与各种分离手段联用灵敏度不够高稀土荧光探针检测

儿茶酚类化合物的原理单纯的TbCl3，Tb-DCTA体系和DOPAC在实验用的波长条件下(298nm,546.8nm)都没有荧光信号，可见体系发光是由于形成了Tb-DCTA－DOPAC三重络合物并发生了能量转移得结果。DOPAC的荧光图红：激发波长为279nm蓝：激发波长为298nmTbCl3的荧光图红：激发波长为298nm蓝：激发波长为240nmTb－DCTA荧光图玫红：激发波长为240nm绿：激发波长为240nm（三重络合物，Tb－DCTA浓度同上）绿：激发波长为298nmTb－DCTA－DOPAC体系荧光图绿：激发波长为240nm红：激发波长为279nm蓝：激发波长为298nm1.三元络合物的形成三元络合物体系：1.离子缔合三元络合物2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合物Tb－DCTA－CAs体系：Tb与DCTA先行络合，然后Tb余下的空位再与CAs络合，形成三重络合体系

2.三元络合物发光机理(1)配体受激后,单重态（S1）有三种方式退激：

a.产生荧光的辐射跃迁(S1-S0)b.系间窜跃(S1-T1)c.无辐射跃迁回基态(ISC)三重态（T1）也有三种退激方式：

a.产生磷光的辐射跃迁(T1-S0)b.通过无辐射转移跃迁到Tb3＋的激发态(ET)，c.无辐射跃迁回基态(T1～S0)。2.三元络合物发光机理(2)分子内能量转换效率的影响因素：1.配体最低的激发三重态（T1）能量高于Tb的5D4能级的能量2.能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和几率相当高2.三元络合物发光机理(3)儿茶酚胺的磷光发射波长在409

nm－417nm，亦即其三重态（T1）的能量高于Tb3＋的5D4能级约3800-4000cm－1高量子产率和跃迁几率能量转移速率常数高达1010s－1由水或解离的氧导致的配体三重态（T1）以及Tb3＋，发光的猝灭也大大减少了。实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择：1.Eu3＋+EDTA体系；2.Eu3＋＋phen体系；

小结：最终弃用这两个体系的原因，是其适用的pH范围太低，难以使DA的羟基充分解离形成三元络合物。实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：

3.Tb3＋+EDTA体系（1）：

Tb:EDTA＝1:1（浓度均为2mmol/L）,

pH＝11,λex＝300nm，λem＝545nm,加入甲醇（分析纯）、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意检测限，DA为10－5

mol/L小结：目前研究最多的体系，适用的pH相对于前两个体系有了很大提高，但是仍然未能达到文献报道的结果

实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：

3.Tb3＋+EDTA体系（2）：

Tb:EDTA＝1:1（浓度均为2mmol/L）,pH＝11,λex＝240nm，λem＝545nm,出现递减结果小结：在λex＝240nm，λem＝545nm,出现的Tb3＋特征波长处的递减结果，可能是由于在检测条件下,Tb－EDTA体系能发出Tb3＋的特征荧光，而待测物与之形成三重络合体系后,激发波长红移，亦即三重络合体系的形成导致了一部分Tb3＋特征荧光的猝灭。A．CDOPAC－Fluro图B．CDA-Fluro图实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择：4.Tb3＋+DCTA体系：20ºC时，Tb3＋与EDTA的络合常数lgK1为17.93，而与DCTA的络合常数lgK1为20.20*

因此本体系可以在更高pH下存在，更利于三重络合物形成pH影响0.4mmol/LTb3＋－DCTA，2×10－5mol/LDOPAC，横坐标为pH0.2mmol/LTb3＋DCTA，4×10－5mol/LDOPAC溶液（色谱纯甲醇：重蒸水＝9：1），横坐标为5ml样品中10mol/LNaOH的体积表面活性剂的影响由于水分子对荧光有相当的猝灭作用，体系又是在水相中，因此尝试加入表面活性剂进行改进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形成的胶束中得到保护，起到敏化作用。共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠，阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和非离子表面活性剂TOPO。都未起到期望的对体系的改善作用。甲醇含量影响0.2

mmol/LTb3＋－DCTA，4×10－5mol/LDOPAC溶液，NaOHfixed重原子影响重原子对于荧光体系有时也可起到敏化作用。实验尝试向体系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入对体系的荧光有明显得增强作用，最后选择CsCl浓度为0.1mol/L。加样顺序影响Tb＋DCTA，甲醇，NaOH，CsClTb＋DCTA，甲醇，

CsCl，

NaOHTb＋DCTA，NaOH，甲醇，

CsClTb＋DCTA，NaOH，CsCl，甲醇Tb，DCTA，甲醇，NaOH，CsClDCTA，甲醇，Tb，NaOH，CsCl实验操作向5ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1ml、10mol/LNaOH溶液0.04ml、10mol/LCsCl溶液0.05ml、色谱纯甲醇4.5ml，混匀。在检测前再加入待测物，用重蒸水定容至5ml，在激发波长为298nm，发射波长546.8nm处用0.5cm比色池测定荧光强度。实验结果a.CDA－Fluro图b.CDOPAC-Fluro图

实验结果c.C邻二酚－Fluro图d.C3，4－二羟基苯甲酸－Fluro图实验结果

被测物指标多巴胺（DA）3,4－二羟基苯乙酸（DOPAC）邻二酚（儿茶酚）3,4－二羟基苯甲酸线性范围8×10－8－8×10－6mol/L8×10－8－8×10－6mol/L

8×10－8－8×10－6mol/L

8×10－8－8×10－6mol/L

线性相关系数0.99880.99920.99670.9982检测限5.2×10－8mol/L3.6×10－8mol/L5.7×10－8mol/L2.97×10－8mol/L1.证明了CAs能够与Tb和另一配