第五章体外技术

第五章体外分析技术体外分析技术主要是利用放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行肌体内物质种类和含量的分析测定。体外分析技术的典型代表——放射免疫分析（RIA）竞争性体外放射分析法：非竞争性体外放射分析法：标记抗原和未标记抗原对抗体都有相同的结合能力，但是当抗体的量有限时，这种结合就出现相互竞争，彼此抑制。用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测抗原同放射标记抗体进行全量反应。RIA特点：灵敏度高(可测水平达10-12—10-15g)特异性强操作简便，成本低应用广泛目前可用RIA测定的微量物质：激素、蛋白质、环磷酸腺苷、抗原、抗体、维生素、药物等300多种第一节放射免疫分析(RIA)放射性标记的抗原和非标记抗原(标准抗原或被测抗原)同时与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应，这种竞争关系可用以下反应来表示：*Ag：标记抗原Ag：非标记抗原Ab：特异性抗体*Ag-Ab：标记抗原抗体复合物Ag-Ab：非标记抗原抗体复合物一、基本原理：*Ag与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力；当*Ag和Ab为恒定量，Ag和*Ag的总量大于Ab上的有效结合点时，*Ag-Ab的形成是随着Ag量的增加而减少，剩下来的未结合或游离的*Ag则随着Ag量的增加而增加；测定*Ag-Ab或*Ag即可推出被测的Ag量。放射免疫分析原理示意图

标准曲线：

配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B或游离*Ag的放射性F，计算出结合率B%［B/(B+F)×100%］或其他指标。以B%或B/B0%为纵座标，标准抗原的浓度为横座标，绘制曲线即为标准曲线(standardcurve)。（一）抗体：

抗体的亲和力是抗体与抗原之间相互作用的一种结合能力或强度。亲和力大即免疫结合既快又牢固，不易重新解离。Ag+Ab

Ag-Abk1k2亲和力的大小用亲和常数（affinityconstant）Ka值来表示，Ka＝k1/k2

，一般要求Ka值在1010～1012

L/mol之间。

二、基本试剂亲和常数Ka的计算最常用的方法是标准作图法：即以B/F为纵坐标，以［B］为横坐标，得到一条直线，其斜率的负数即为Ka标准分析图抗体的特异性

指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物的结合能力的比较。交叉反应率=ED50（B）/ED50（A）×100%

抗体与相应抗原结合能力强，而与该抗原结构类似物结合能力弱，则特异性高。抗体与抗原结构类似物的结合称交叉反应（crossreaction）抗体的滴度指抗体实际应用时的稀释倍数，稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表示抗体的效价越高。将抗血清稀释成不同浓度，分别加入定量标记抗原，充分反应后分离B、F，以稀释度为横坐标，B0%为纵坐标绘制标准曲线。B0%为30%~50%的稀释度为最佳稀释度。（二）标记抗原：

对标记抗原的要求：1．比活度(specificactivity)：比活度越高，灵敏度越高。2．放射化学纯度(radiochemicalpurity)：指具有免疫活性的标记抗原的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。3．免疫活性：蛋白质分子上标记过多的碘原子就可能引起免疫活性的改变，一般以每个蛋白质分子上只标1～2个125I原子为宜。4．半衰期：合适，保证制造、运输、分析整个过程。（三）标准品：

对标准品的要求：1．标准品(standard)与被测物应属同一种物质2．在与抗体发生反应时，应与被测物具有相等的活性和亲和力3．高度纯化4．定量精确已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，做标准曲线用。（1）分离的目的是使抗原抗体复合物和游离抗原分开，以便测量B与F；（2）游离抗体及非标记抗原无放射性，不干扰测量；（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。（四）分离方法双抗体法(测量B)：用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离出来，称为双抗体法（doubleantibodymethod）。优点：B和F分离较为完全，非特异性结合低，使用方便。缺点：分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋白质及盐含量的影响。双抗体示意图沉淀法(测量B)：某些中性盐和有机溶剂（如聚乙二醇（PEG）或碱金属中性盐等）在一定条件下，能使抗体与抗原复合物沉淀。优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。缺点：分离效果易受pH值、离子强度、温度、蛋白质含量的影响，且非特异性结合较高。双抗体＋沉淀法(测量B)：将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点。活性炭吸附法(测量F)：活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射性F。优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特异性结合较高。固相分离法(测量B)：将抗体或抗原通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab复合物，可与游离部分分离。优点：操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低。（五）放射性测量仪器γ井型计数器：测γ射线，125I标记液体闪烁计数器：测β射线，3H、14C等标记配计算机系统，自动测量、数据处理、打印结果。基本操作过程：

放免测定一般包括加样、温育、分离B与F、测量与数据处理五个步骤放射免疫分析法的必备条件和基本步骤质量控制（qualitycontrol，QC）包括实验室内质量控制（internalqualitycontrol）与实验室间质量控制，实验室内质量控制又包括批内质控与批间质控。三、质量控制(一)实验室内质量控制：是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有可比性。

零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。最低浓度管与最高浓度管的结合率之差：＞30%。标准曲线直线回归的参数：包括截距a、斜率b和相关系数r，要求a、b值稳定，r＞0.99。ED25、ED50与

ED75：指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。质控图：连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为质控图。WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃：①三种QCS中有一个测定值＞3s；②三种QCS中在同一方向上有两种＞2s；③三种均在同一方向上＞1s。1、精密度(precision)：批内CV＜5%，批间CV＜5%~10%又称重复性，指同一样品在多次重复测定中所得结果的一致程度。以标准差(SD)和变异系数(CV)表示(二)试剂盒质量控制：指测定方法的最小可检出量，即从生物样品中能够检出某物质的最小浓度。2、灵敏度（sensitivity）：准确度(accuracy)指测定值与已知真实值的符合程度。可用回收率（recoveryrate）来表示:回收率%＝

测定值/真实值×100%一般要求达到90%～110%。3、准确度：5、稳定性：4、特异性：取决于抗体的特异性，交叉反应越少，特异性越好。指试剂盒在适宜的温度等条件下，在有效期内保持原有性能不变的能力。健全性（perfection）是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。用标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断方法的可靠性。平行性好者可靠性好。健全性6、健全性：(三)实验室间的质量控制：实验室外质量控制是对各实验室之间测定结果按统一评价方案及方法比较分析，以提高各实验室之间所得结果的可信性和可比性。

第二节免疫放射分析(IRMA)一、原理将过量的标记抗体与抗原结合，分离结合的标记抗体与未结合的多余的标记抗体，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg：抗原*Ab：标记抗体Ag-*Ab：抗原与标记抗体的复合物二、特点免疫放射分析法有以下特点：1．以标记抗体作为示踪剂。2．反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。3．灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的10～100倍。4．标准曲线工作范围宽。5．特异性高。6．稳定性好。7．目前仅限于蛋白质和多肽抗原。三、常用方法抗体夹心法（最常用）：

将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体先与待测抗原反应，形成固相抗体－抗原复合物，再与标记抗体反应，形成固相抗体－抗原－标记抗体复合物附着在管壁上，倾去上清液直接测量反应容器的放射性。

标记第三抗体法：用双抗夹心法中的第二抗体（标记抗体）作为抗原免疫其他的动物获得的抗体为第三抗体。反应后得到固相抗体－抗原－第二抗体－标记第三抗体的复合物。IRMA和RIA的区别：反应机制不同反应试剂分离方法不同剂量关系反应中的NSBIRMA和RIA工作原理的主要区别：RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的AgAb的量与待测Ag的量呈负相关AgAb的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素一、酶标记的免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA）：将抗原抗体结合的高特异性与酶促反应的高灵敏度有机结合起来，用酶标记抗体（抗原），检测待测标本中未知抗原（抗体），当相应的抗原抗体特异性结合后，加入相应的酶的底物，酶可以高效专一催化和分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色有无和深浅，可以判断待测标本中有无特异性抗原（抗体）以及量的多少。

可以定性、定量，是一种敏感、特异、简便、只需一般光谱分析仪器的微量测定技术。

第三节非放射免疫分析

二、化学发光免疫分析法（chemicalluminescentimmunoassay，CLIA）：以发光物质作为标记示踪物，标记抗原或抗体；是一种超微量分析法。其突出特点是设备简单，试剂稳定，无放射性污染。

如是标记抗原，则待测抗原与荧光标记抗原竞争结合有限量抗体，反应达到平衡后，将游离标记抗原与发光标记抗原-抗体复合物分离，然后处理复合物，使其发光物质发光，其中发光强度与待测抗原呈负相关；非竞争法中，用发光物质标记抗体，与IRMA法原理相似。三、时间分辨荧光分析法（timeresolvedf