基因工程第三章克隆载体-1汇总

第三章基因克隆载体

Chapter3GeneCloningVector1/321计划学时:4h第一节质粒载体(plasmidvector)第二节病毒载体(virusvector)第三节染色体定位整合载体(chromosomepositionfixingvectors)第四节酵母人工染色体载体(YACvector)第五节特殊用途的载体2/322克隆载体的定义通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。3/323载体的特点有多克隆位点,供外源DNA插入。多克隆位点(multiplecloningsite,polylinker):具有多个限制酶的识别序列,可供处源DNA片段插入.携带外源DNA进入受体细胞(receptorcell,hostcell)，并能自我复制。有选择标记基因(markergene),例如：抗抗生素基因。载体要安全，对受体安全，不能转入其他生物，尤其人细胞。4/324Theessentialnucleotidesequencesofcloningvectors:Areplicationorigin,Adrug-resistancegene,Multiplecloningsites.复制起始位点抗氨苄青霉素基因多克隆位点5/325第一节质粒Plasmid1.1定义细菌染色体之外的能自主复制的双链环状DNA分子。

Circular,double-strandedDNA(dsDNA)thatareseparatedfromthechromosomalDNAinbacteria.1质粒的特点6/326质粒载体(Plasmidvector):以质粒DNA分子为基础构建(construct)而成的克隆载体。构型:超螺旋supercoilRelaxedDNASupercoilDNA7/3271.2质粒的大小天然质粒:1kb~100kb质粒载体较小,有的只有3kb,具有作为载体的必须序列即可。200kb3kb8/3281.3质粒的复制Replication每次细胞分裂，质粒均可复制传给子代细胞。一般，细胞中质粒的拷贝数保持稳定。9/329松驰型质粒：拷贝数多，小质粒。严紧型质粒：拷贝数少，大质粒。200kb<5kb10/32101.4质粒的不亲合性能寓于同一细胞的质粒为亲合性质粒不能寓于同一细胞的质粒为不亲合性质粒。布什本.拉登布什布莱尔受体细胞最好无内源质粒.11/32111.5质粒的迁移性接合质粒：含有tra基因，可连接宿主细胞和受体细胞，并在两者间转移。

特点:

大，拷贝数少，宿主多，不安全。非接合质粒：无tra基因，

特点:

小，拷贝多，宿主少，安全，常用载体。接合质粒染色体12/3212隐蔽质粒：引入后，受体细胞的遗传特性无变化。显性质粒：引入后，为受体细胞提供了新的遗传特性。如：抗抗生素，颜色变化等。1.6显性质粒与隐蔽质粒13/32132质粒载体的构建2.1选择合适的出发质粒，并用限制酶切开。好的质粒应具备：复制起始位点（ReplicationOrigin，Ori）标记基因（Markergene）多克隆位点（Multiplecloningsite）启动子（Promoter）终止子（Terminator）14/3214多克隆位点标记基因Ori启动子终止子EcoRI合适的质粒15/32152.2获得合适的DNA片段.DNA也要用限制酶切开，有两个粘性末端。易于DNAligase连接.16/32162.3、重组连接混合酶切后的DNA片段和载体，加入DNAligase催化连接。17/3217质粒克隆6018/32183Ti质粒载体Ti质粒:农杆菌中可引起寄主产生肿瘤的质粒。Tiplasmid(tumor-inducingplasmid)农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)19/32193.1Ti质粒的组成（4个功能区）（1）T-DNATi质粒中能转移进入植物细胞内的DNA片段。长约20kb，包含冠瘿碱合成和冠瘿瘤生长基因20/3220T-DNA的结构特征：

T-DNA区两端具有25个碱基对的顺向重复序列称为边界序列。21/3221右边界序列更重要。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对无明显影响。22/3222Leftborderrightborder只要保留边界序列，T-DNA的其它序列被外源DNA片段替换，仍可转入植物基因组。23/3223（2）

Vir区:位于T-DNA上游的一组基因，可引起T-DNA的转移，长度约35kb

（3）

Con区：含有与农杆菌之间接合转移有关的基因（tra），使Ti质粒在细菌间转移。（4）

Ori区：复制起始区.24/3224LeftborderrightborderLeftborderrightborderVirregionConregionOriregion25/3225农杆菌感染后，植物细胞接受刺激释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。3.2基因转化过程26/32Leftborderrightborder263.2、Ti质粒载体的构建(Construction)构建Ti质粒克隆载体不是真正用于农杆菌，而是用于植物，农杆菌起介导作用。27/3227共整合载体法：将目的基因克隆引入常规质粒，在目的基因两侧分别引入T-DNA左右边界.转入农杆菌，经内同源重组，将目的基因整合到农杆菌的T-DNA区，再转化植物。28/3228Bacteriacelltransfer同源重组共整合载体法plasmidLeftborderrightborderAimgeneplantcellTiplasmidInfectplantcell29/3229二元载体法利用Vir区和T-DNA区（具Tborders）分别构建两个质粒，并转入农杆菌。Vir区基因群反式作用，将含外源基因的T-DNA转入植物染色体。30/3230plantcellChromosomeDNABacteriacellInfectplanttransferplasmidPlasmid-1plasmidrightborderLeftborderAimgeneVirreg