第三章固定化酶反

第三章固定化酶反应动力学酶的固定化外扩散对固定化酶反应动力学的影响内扩散对固定化酶反应动力学的影响内外扩散同时存在时的限制效应扩散影响下的动力学假象3.1酶的固定化背景酶的固定化方法影响固定化酶活力的因素固定化对酶动力学特征的影响3.1.1背景游离酶参与反应的缺点：1）稳定性差、液相中含量少，2）反应结束后不易回收、3）酶、底物和产物处于同一相，对产物分离不利固定化酶：即水不溶性酶，是通过物理的或化学的方法，将溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束，或受到局部约束的一种不溶于水但仍具有催化活性的酶，它能以固相状态作用于底物进行催化反应其优点：可以长期保留在反应器内反复使用，易实现连续化生产；反应结束后易与产物分离，简化了产物分离工艺，其大多数固定化酶稳定性也比游离酶好缺点：活力会下降，反应易受传质速率的控制，对大分子底物、产物不适用研究历史：1916年，Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被吸附到骨碳粉末上，并在吸附状态下具有催化活性；以后以色列科学家对酶的固定化方法、固定化的理化性质等进行了开创性的研究，1969年日本的千叶一郎将固定化氨基酸酰化酶应用于DL－氨基酸的拆分上，1971年国际酶工程会议给出了固定化酶的定义。3.1.2酶的固定化方法载体结合法交联法：主要靠双功能试剂戊二醛等使酶分子发生交联包埋法物理结合法离子结合法共价结合法凝胶包埋微胶囊包埋纤维素包埋影响固定化酶催化活力的因素构象效应：由于载体与酶之间的共价键作用，引起酶的活性部位发生扭曲变形，改变了酶活性部位的三维空间结构，减弱了酶与底物的结合力，导致酶的活性下降。位阻效应：由于载体选择不当或载体空隙太小，致使酶的活性部位不易与底物结合，对酶的活性部位造成了空间障碍。分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等，使得底物和产物及其效应物在微环境和宏观环境中浓度不同的现象。扩散效应：底物、产物和效应物的迁移和运转速率受到限制的一种效应。酶的固定化对其动力学特征的影响原因：由于酶的活性中心的氨基酸残基的空间结构和电荷状态发生了变化，或者固定化酶的周围形成了能对底物传递产生影响的扩散层或静电的相互作用等。对底物专一性的改变稳定性的改变最适pH值和温度的改变米氏常数的改变由于形成立体障碍，高分子底物难以接近固定化酶分子，使酶的底物特异性发生改变。如胰蛋白酶固定在羧甲基纤维素上时，对二肽和多肽的作用保持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%。固定化酶的稳定性好，主要表现为热稳定性、保存和使用稳定性的增加，另外，对蛋白酶的抵抗性和对变性剂的耐受性也增强了。酶最适pH值的变化的原因与载体的带电性质及酶所催化所得产物的性质有关。当酶固定在多聚阳离子载体上，最适pH将向酸性一侧移动；若酶固定在多聚阴离子载体上，最适pH将向碱性一侧移动。如果催化产物为酸性，则固定化酶的最适pH要比游离酶低一些，若产物为中性，则无变化。但pH变化不会超过2个pH单位。最适温度可较游离酶高，如醋酸纤维素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶的糜蛋白酶的最适温度比游离酶分别高5~15℃。

若有扩散阻力，则表观米氏常数变大，若分配系数大于米氏常数，则表观米氏常数减少。酶的固定化，不仅使酶的活性发生了改变，而且由于固定化酶的引入，反应体系变为多相体系。因此在研究固定化酶催化反应动力学时，要同时考虑物质传递对酶促反应过程的影响。3.2外扩散的限制作用特点液固相间的传质速率外扩散的限制作用外扩散有效因子外扩散与化学抑制同时存在时动力学3.2.1外扩散的特点酶促反应过程与传质过程是各自独立的底物先从液相主体扩散到固定化酶的外表面发生反应产物从固定化酶的外表面扩散进入液相主体3.2.2液固相间的传质速率由于搅拌，反应体系中的液相主体的底物浓度处处相同，假定为S0，底物在颗粒表面因反应而消耗，同时由于液体的粘性，在固液表面附近产生一个滞流层，而固体表面液体流速率为0，因而在滞流层产生浓度梯度，进而导致物质的传递，常在底物浓度为主体浓度99%处假想有一个边界层，边界层理论认为：1）边界层外底物浓度是均匀的（产物浓度也均匀）2）颗粒表面外各处的液膜厚度相等，且边界层厚度与流速有关3）边界层内无反应发生，传质阻力全部集中在边界层内4）定常态下，液膜内物质传递只有分子扩散，且传质速率一定，即S0SiRR+δNs——以面积为基准的传质通量，即单位时间沿半径方向通过单位截面积的底物的量Kg/(m2s)或mol/(m2s)Ns与浓度的关系可用Fick第一定律来表示，给定边界条件

积分得在固定化酶外表面处传质速率为

其中Ds为底物在液相中的分子扩散系数，m2/sa为固定化酶的比表面积，m-1

KL表示在液体流动的垂直方向上单位面积、单位时间所通过的底物的量3.2.3外扩散的限制作用固定化酶外表面的反应速率可表示为当化学反应速率和传质速率相差不大时，体系在稳态条件下，有下式成立，传质速率＝化学反应速率，即：求解此方程，得出无因次化处理，令

解之得：，当B>0时取+号；当B<0时，取-号，其中。此外可以采用作图法求得固定化酶外表面上的底物浓度。

这里，Da准数是对反应控制步骤进行描述的一个重要的无因次数群，其物理意义为，因此当Da>>1（50）时，此时固定化酶反应的控制步骤为传质，此时Si=0,RSi=KLaS0，反之，当Da<<1(0.1)，此时固定化酶反应的控制步骤为动力学（化学反应速率），即称为最大本征反应速率。3.2.4外扩散有效因子，根据此定义式知：因此可以根据判断外扩散的影响。在利用固定化酶进行反应时，总是希望尽可能接近1，此时应控制反应条件，使Da准数尽可能地小，由知，可以通过降低固定化酶颗粒的粒径，提高液体的流速及适当增加液相主体的底物浓度来使Da减小。的关系由右图可以看出：当底物浓度增加而Da不变时，随着底物浓度的增加，增加，即增加底物浓度，可以克服外扩散的影响，当底物浓度不变时，Da增加，减少，且当Da<0.1时，接近1。可观测丹克莱尔准数（）令，当传质速率和反应速率相差不大时，在稳定状态下有下式成立，，因此得到，从此式中可以看出：当时，，外扩散影响可忽略，当时，，外扩散影响明显。怎样识别外扩散的影响？3.2.5外扩散与化学抑制同时存在对于非竞争性化学抑制，若又存在外扩散的限制作用，当达到平衡时，有下式成立：引入无因次数群：在不同的Da下，例题将酶固定在无微孔的球形载体上，测得其本征动力学参数分别为，现将该固定化酶颗粒放在一底物浓度为的液相中进行反应，已知该操作条件下，求：1）、底物在固定化酶外表面上的反应速率2）、外扩散有效因子解：在有扩散影响的固定化酶反应中，体系达到平衡时，底物在外表面上的反应速率即为表观反应速率，。3.3内扩散的限制作用特点液体在微孔内的扩散速率微孔内反应与扩散的关系式内扩散有效因子表观泰勒模数3.3.1内扩散的特点对于多孔的固定化酶颗粒或膜，具有催化作用的部位基本上是在微孔的内表面，因此扩散过程和反应过程是同时发生的。在微孔内，由于内扩散阻力的存在，反应组分在微孔内的浓度分布是不均匀的，对于底物，其浓度在固定化酶外表面处最高，在颗粒或膜中心处最低，形成了由表及里浓度逐渐降低的分布，由于反应和扩散同时进行，所以沿微孔方向，反应速率也在下降，在颗粒中心处，反应速率最低。扩散过程与微孔结构密切相关。3.3.2液体在微孔内的扩散液体在单一圆柱形微孔内的分子扩散速率可用Fick第一定律来表示：

其中Ds为底物在液相中的分子扩散系数，一般在1×10－9m2/sz为沿扩散方向的距离，mNs为底物在单位时间内通过单位截面积微孔的量，moL/(m2s)但固定化酶颗粒或膜的微孔是非圆柱形的，底物在微孔内的扩散系数要比在液相主体中小得多，工程上采用有效分子扩散系数来表示。扩散中发生在微孔内，且微孔面积与颗粒外表面积之比等于孔隙率微孔的形状是弯曲的，因此引入曲节因子，故在有效分子扩散系数可表示为3.3.3微孔内扩散与反应的关系式球状固定化酶片状固定化基本假设模型的建立颗粒内底物浓度与扩散阻力的关系1、球状固定化酶之基本假设固定化酶颗粒是等温的颗粒内传质为扩散，且服从Fick第一定律，Des不随位置而变化颗粒是均匀的，不仅其活性分布均匀，性质也均匀底物与产物分配系数为1，固定化酶活性稳定反应为单底物限制，底物与产物的浓度仅沿半径方向变化球状固定化酶之模型的建立假定球状固定化酶的半径为R，在距球中心为r处取一壳层，其厚度为dr，底物通过微孔由外向内扩散，且通过此壳层，底物在（r+dr）处扩散进入，在r处离开，并在壳层内发生酶促反应而消耗底物，以扩散方面为正方向，则单位时间内扩散进入微元壳层的底物的量为单位时间内由扩散离开微元壳层的底物的量为：单位时间内微元壳层内的底物的反应量为在稳态条件下，沿扩散方向，底物的物料衡算式可表示为流入量－流出量＝反应量，即：rr+dr扩散方向上式可变为，重排后得两边同除以r2dr，得即上式变为

球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之一双曲函数，首先要进行无因次化处理：令

对于球形固定化酶，，则有

整理：即：，利用边界条件求解：该方程无解析解，只有数值解（数值计算法是研究数学问题的一类近似解法，即从一组原始数据，按照某种确定的运算规则，进行有限步运算，最终获得数学问题数值形式的满足某种精度要求的近似解，如龙格库塔法，近似解也可做成图）底物浓度沿半径分布图从右图可以看出，对同一位置r处，随着Φ的增加，底物浓度在减少。Ф的大小，表征了内扩散阻力的大小，因此随内扩散阻力的增大，同一位置处底物浓度减小，而且当Ф不变时，愈往颗粒内部，底物浓度越小。当内扩散阻力较小时，Ф＝0.2,1,底物可以到过颗粒中心处，但当内扩散阻力较大时，Ф=5,10,底物还未达到颗粒中心处就反应掉了。球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之二当，同样对进行无因次化处理，得，同样给定边界条件进行求解，得球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之三当对于零级反应动力学，反应速率与底物浓度无关，但要发生反应，必须有底物存在，同样给定边界条件对其进行求解，得当底物浓度一定时，使固定化酶颗粒中心处底物浓度恰好为0的颗粒半径，称为临界半径，2、片状固定化酶假定酶膜的厚度为2L，但厚度与其长度与宽度相比要小得多，因此底物的扩散只考虑与两个大的侧面相垂直方向上的扩散，而忽略其他四个侧面的扩散，同样取一厚度为dl的微元体，做底物的物料衡算：假定酶膜的面积为A，则单位时间进入微元体底物量表示为单位时间流出微元体的底物量为

单位时间内微元体内反应的底物量为扩散方向对底物进行物料衡算：流入－流出＝反应消耗同样，底物沿扩散方向的浓度分布与rs的形式有关，当酶膜完全浸在反应液中时，若，同样进行无因次化处理，令

则上式变为，同样给定边界条件：同样此方程只有数值解，没有解析解。当，无因次化处理得，解得

当

同样也存在临界厚度的问题：要注意利用膜作固定化酶的载体时，膜与液体双面接触和单面接触梯勒模数是不同的3.3.4内扩散有效因子内扩散有效因子的定义一级反应动力学表达式有效因子的一般表达式零级反应表达式1、有效因子的定义定义：在稳态条件下，RS应等于从颗粒外表面处向微孔扩散的速率，即当无外扩散影响时，，对于球状固定化酶，2、一级反应动力学当，

即而对于片状固定化酶固定化酶形状对有效因子的影响随着的增加，下降，当，为动力学控制区，说明内扩散阻力很小，但当>3时，内扩散阻力明显，内扩散成为控制步聚，此时，为过渡区。此外，固定化酶几何形状不同，对关系影响不大，特别是在较小或较大时。3、有效因子的一般形式当，对于球状固定化酶，进行无因次化处理，则因为S~r之间无解析解，因此亦无解析解，因而

由此可看出，当增加时，下降，而，从中可以看出影响泰勒模数的因素：1）颗粒大小或厚度，即，对的影响明显，又称为特征尺寸，越大，值越大，越小，因此为了减少内扩散的影响的限制，反应中应尽可能采用小颗粒。2）颗粒活性，即动力学参数3）有效分子扩散系数4、零级反应动力学对于零级反应动力学，只要整个球形固定化酶颗粒内部有底物存在，反应就可以进行，此时，若由于内扩散的影响，使得底物在固定化酶颗粒某一位置r处浓度为0，则定义一个零级反应的泰勒模数，来计算零级反应的有效因子，定义：对于球形固定化酶，

3.3.5表观泰勒模数定义：，对于球形固定化酶，由得当3.4内外扩散同时存在的限制效应内外扩散同时存在时的有效因子（一级反应动力学）：定义总有效因子3.5扩散影响下的假象扩散影响的判定扩散对反应级数的影响扩散对活化能的影响扩散对固定化酶稳定性的影响3.5.1扩散影响的判定直接法：如果在相同的反应条件下，只改变底物的流速，如果流速改变，底物的转化率也随之改变，说明存在外扩散的影响，继续提高流速，转化率不再改变，说明消除了外扩散的影响，在此基础上，维持相同的反应条件，只减少固定化酶的特征尺寸，随着特征尺寸的减少，，底物的转化率增加，说明存在内扩散的影响，继续减少特征尺寸，直到底物的转化率不变，说明内扩散的影响消除。图解法：根据Arrhenius定理，因此如果存在内扩散的影响，则活化能减半，如果受外扩散的影响，活化能为0。3.5.2扩散对反应级数的影响若酶反应的本征动力学可表示为，若只有内扩散有影响，则