第2章天然药物化学成分的提取与分离

第二章

天然药物化学成分提取分离

和鉴定的方法与技术导学情景情景描述

小林是中职药剂专业的一年级学生，这天去奶奶家做客，奶奶患有心脏病，医生给开了某品牌的心血康胶囊，只见里面的药品说明书是这么写的“规格：每粒含甾体总皂苷100mg（相当于甾体总皂苷元35mg）”。小林心生疑虑，皂苷这药名之前老师都没介绍过，到底对奶奶的病情有否帮助呢？学前导语该品牌心血康胶囊是以天然药物中的薯蓣科植物黄山药为原料，经提取得到其主要成分甾体总皂苷，可用于治疗冠心病、心绞痛等疾病。那么如何从天然药物中提取得到相应的主要成分？

植物成分按其溶解性可以分类如下：植物成分水溶性成分醇溶性成分脂溶性成分游离生物碱、苷元、非水溶性有机酸、树脂、挥发油、脂溶性色素、油脂和蜡（除少数外，仅热时可溶于醇）蛋白质、黏液质、单糖和低聚糖、氨基酸、水溶性有机酸、鞣质、苷类及水溶性色素、生物碱盐其他成分淀粉（冷水不溶、热水不溶、在有机溶剂中均不溶）无机成分植物细胞壁成分分离混合物提取粗粉有效成分本章内容

第一节提取方法和技术第二节分离精制和鉴定的方法与技术

第一节：提取方法和技术教学目标：

1、理解溶剂提取法的原理2、掌握各种溶剂提取法的特点、适用范围和操作要领3、熟悉水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法的原理、特点及应用范围天然药物中有效成分的提取分离存在两种情况：欲提取物为已知成分或化学结构类型；从天然药物中寻找未知有效成分或有效部位。提取的概念：指用选择的溶剂和适当的方法，将所要的成分溶解出来并同天然药物组织脱离的过程。常用的方法有：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法和超临界流体萃取法。应用最多的提取方法是溶剂提取法

一、溶剂提取法1概念

溶剂提取法：是指根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全地从药材组织中溶解提出的方法。2提取原理根据“相似相溶”的原理过程：“渗透溶解扩散”动力：在细胞内外液的“浓度差”

3提取前预处理粉碎：考虑药材质地、溶剂性质、提取方法等。脱脂：用压榨法或石油醚溶出药材中的强亲脂性杂质，如：种子类药材中有效成分的提取。4影响因素溶剂的选择：关键提取的方法药材的粉碎度温度时间浓度差

5溶剂的极性（见表2-1）与介电常数有关，溶剂的介电常数越大，极性越强，介电常数小的溶剂极性小。如：己烷为1.9，氯仿为5.2，水为80。亲水性：是指近于水而疏于油的性质。亲脂性：是指近于油而疏于水的性质。极性大小：水(H2O)＞甲醇(MeOH)＞乙醇(EtOH)＞丙酮（Me2CO）＞正丁醇(n-BuOH)＞乙酸乙酯(EtOAc)＞乙醚(Et2O)＞氯仿(CHCl3)＞苯（C6H6)＞四氯化碳(CCl4)＞正己烷≈石油醚(Pet.et)。6常用的提取溶剂及溶剂的选择(1)常用提取溶剂的分类与极性1）分类：水亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂水：是一种强极性溶剂，无臭、无味、无毒，不燃烧，使用安全。包括冷水、热水、酸水、碱水亲水性有机溶剂：是指与水能以任意比例互溶的，放置后不会分层的溶剂。包括甲醇、乙醇、丙酮。亲脂性有机溶剂：是指与水不能互溶或仅能部分互溶的溶剂，放置后与水分为两层。这三类溶剂间互溶情况：水和亲水性有机溶剂可完全互溶，水和亲脂性有机溶剂不能完全互溶，有机溶剂间除甲醇和石油醚不互溶外，其它均互溶。溶剂极性与穿透力沸点℃相对密度与水混溶情况

30～60(常用)0.7不混溶(分层)石油醚小60～9090～120苯(C6H6)80.10.879不混溶(分层)乙醚(无水,Et2O)34.60.713不混溶(分层)氯仿(CHCl3)61.21.484不混溶(分层)醋酸乙酯(EtOAC)77.10.902不混溶(分层)正丁醇(n-BuOH)117.70.810不混溶(分层)丙酮(Me2CO)56.30.792混溶乙醇(EtOH)78.40.789混溶甲醇(MeOH)64.60.791混溶水(H2O)大1001.00

根据上表，说出哪些是亲水性有机溶剂？哪些是亲脂性有机溶剂？

课堂活动溶剂极性与穿透力沸点℃相对密度与水混溶情况

30～60(常用)0.7不混溶(分层)石油醚小60～9090～120苯(C6H6)80.10.879不混溶(分层)乙醚(无水,Et2O)34.60.713不混溶(分层)氯仿(CHCl3)61.21.484不混溶(分层)醋酸乙酯(EtOAC)77.10.902不混溶(分层)正丁醇(n-BuOH)117.70.810不混溶(分层)丙酮(Me2CO)56.30.792混溶乙醇(EtOH)78.40.789混溶甲醇(MeOH)64.60.791混溶水(H2O)大1001.00亲脂性亲水性水：冷水、热水、酸水、碱水等优点：为极性最大的溶剂，也最常用。其穿透能力强，可溶解苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、水溶性色素、无机盐等成分。且具有安全、经济、易得等优点。其中蛋白质不溶于热水。缺点：①水提取液（特别是含糖及蛋白质等）易霉变，不易保存；②含果胶、黏液质类成分较多的天然药物，其水提取液黏度大、不易过滤；③含淀粉量多的天然药物，沸水煎煮时，药材中的淀粉易糊化，过滤困难；④苷类成分含量较高的天然药物，水提取液在减压浓缩时，常会产生大量泡沫，使浓缩困难。故含淀粉量多的天然药物，不宜磨成细粉后加水煎煮。亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。优点：应用范围广，天然药物中的化学成分多可溶于乙醇中，且易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、易燃，有些溶剂毒性较强。亲脂性有机溶剂：溶剂的选择性强，用于亲脂性成分的提取，如游离生物碱、苷元、挥发油等。优点：选择强，提取物纯度较高，溶剂易回收。缺点：价高、易燃、有毒，穿透性差；对设备要求高，使用时应注意安全。注意：药材细胞是植物性的，亲脂性有机溶剂对药材组织的穿透能力较弱，须增大溶剂的用量或延长时间才能提取完全。旋转蒸发仪化学成分的极性被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。(1)影响化合物极性的因素：①化合物分子母核大小(碳原子数多少)：分子大、碳原子数多，极性小；分子小、碳原子数少，极性大。②取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下：－CH3,－CH2－＜－CH＝CH－＜－OCH3,－O－CH2－＜－NO2＜－N(CH3)2＜－COOR＜－C=O＜－CHO＜－SH＜－NH2＜－NH－＜－COCH3＜－OH＜Ar－OH＜－COOH

③结构中双键或共轭双键数目增加，化合物极性增大。举例：判断下列各组化合物极性大小。

ABC

麻黄碱蝙蝠葛碱天然药物化学成分数量繁多，结构千差万别。所以极性问题很复杂，但依据以上三点，一般可以判定。需要大家判断的大多数是母核相同或相近的化合物，此时主要依据取代基极性大小。(2)常见天然药物化学成分类型的极性极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、水溶性色素等。极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大分子有机酸、脂溶性色素等。以上情况不是绝对的，具体成分的溶解性与其结构有关，要具体问题具体分析。7提取溶剂的选择原则

①对欲提取成分溶解度要尽可能大，对共存的杂质溶解度要尽可能小。②不与欲提取成分起化学反应③溶剂应价廉、易得、使用安全。相似相溶原则

为什么用花生酱能去除粘在头发上的口香糖？

课堂活动（一）浸渍法适用于：有效成分遇热易破坏及含淀粉、果胶、粘液质、树胶等多糖物质较多的中药。提取方法(提取技术）浸渍法：是将药材粗粉以适当溶剂在常温或温热条件下浸泡一定时间，浸出有效成分的一种方法。1）操作技术：根据温度不同，可分为冷浸法和温浸法。①冷浸法：药材粗粉，加入一定量溶剂如水、酸水、碱水或稀乙醇等，时时振摇或搅拌，在室温条件下浸渍1～2天或规定时间，使有效成分浸出，滤过，用力压榨残渣，合并滤液，静置滤过即得。②温浸法：操作与冷浸渍法基本相同，但浸渍温度一般在40～60℃之间，浸渍时间较短，能浸出较多有效成分。由于温度较高，浸出液冷却后旋转贮存常析出沉淀，为保证质量，应滤去沉淀。2）适用范围：适于成分遇热易破坏或含多糖（如：淀粉、果胶、黏液质、树胶等）较多的天然药物的提取。3）特点：操作方便，简单易行，但效率低，提取时间长，水提取液易发霉，提取液体积大。4）提示：为保证成分充分提出，应提取2～3次，第2、3次浸提的时间可缩短，合并浸出液，滤过，经浓缩后可得提取物。必要时须加适量防腐剂如甲苯、甲醛或氯仿等。

（二）渗漉法：是将天然药物粗粉装于渗漉筒中，连续不断添加溶剂使渗过药粉，从渗漉筒中自上而下端不断流动，浸出有效成分的一种动态浸提方法。1）操作技术：①粉碎：将药材粉碎成粗粉。②浸润：根据药粉的性质，用规定量的溶剂（一般为每1000g药粉约用600～800ml溶剂）润湿，密闭放置15分钟至6小时，使药粉充分溶胀。③装筒：取适量脱脂棉垫于渗漉筒底部，用相同的溶剂湿润，然后分次装入已润湿好的药粉，每次装粉后用木槌压平，力求松紧适宜，药粉装量一般以不超过渗漉筒体积的2/3为宜，药面上盖滤纸或纱布，再均匀覆盖一层清洁的细石块。④排气：装筒完毕后，打开渗漉筒下部的出口，缓缓加入适量溶剂，使药粉间隙中的空气受压由下口排出。⑤浸渍：待气体排尽后，关闭出口，流出的渗漉液倒回筒内，继续加溶剂使保持调出液面浸渍。⑥渗漉：浸渍时间24～48小时，即可开始渗漉，控制流速，《药典》规定一般以1000g药材每分钟流出1～3ml为慢速，3～5ml为快速，实验室常控制在每分钟2～5ml之间，大量生产时，可调至每小时漉出液约为渗漉器容积的1/48～1/24。⑦收集渗漉液：一般收集的渗漉液约为药材重量的8～10倍，或以有效成分的鉴别试验决定是否渗漉完全，最后，经浓缩后得到提取物。装置如图：优点：适用于热敏物质，操作简单缺点：提取效率低，溶剂用量大2）适用范围：遇热易破坏成分。3）特点：溶液浓度差较大，浸出效果好，提取效率高于浸渍法，且成分不破坏。缺点为溶液体积大，提取时间长。4）提示：常温提取。多用水、酸水、碱水及不同尝试的乙醇等。

工业生产用的渗漉装置（三）煎煮法适用于：能溶于水且遇热稳定成分的提取。煎煮法：为天然药物水提取最常用的方法。将天然药物粗粉用水加热煮沸，保持一定时间，成分即可浸出。1）操作技术：药材加水，置适当容器中，加水浸没药材，煮沸，保持微沸，煎煮一定时间后，分离煎煮液，药渣加水继续煎煮提取数次，合并各次煎煮液，浓缩即得。一般提取2～3次，小量提取时，第一次煮20～30分钟，大量提取，第一次煮1～2小时，第2，3次煎煮时间可酌减。2）适用范围：适用于有效成分能溶于水且不易被水、热破坏的天然药物的提取。3）特点：操作简单，提取效率高于冷浸法。4）提示：不宜用于有挥发性及遇热易破坏成分的提取，且含多糖丰富的药材，因提取液黏稠过滤困难，不宜使用。提取有效成分时忌用铁器，否则提取液颜色较深。

（四）回流提取法：用于以有机溶剂加热提取成分。1）操作技术：将药材粗粉置于圆底烧瓶中，加溶剂至盖过药材面1～2cm，接冷凝管，通入冷水冷凝，于水浴上加热回流一定时间，滤出提取液，药渣再添加新溶剂回流2～3次，合并滤液，回收有机溶剂后得浓缩液。2）适用范围：适用于脂溶性较强的天然药物化学成分的提取。3）特点：优点为提取效率高，但受热易破坏成分不宜用此法。缺点为溶剂消耗量大，需回流设备，需几次提取方可提取完全，操作麻烦。4）提示：由于受热时间较长，故对热不稳定成分的提取不宜采用。（五）连续回流法：本法是使用连续回流装置用有机溶剂进行提取的一种方法1）操作技术：实验室提取时用索氏提取器由冷凝管、提取器、烧瓶三部分组成应用时将药材粗粉装入滤纸袋中，放入提取器内，高度不能超过虹吸管顶端高度，烧瓶内的溶剂经水浴加热气化，通过提取器旁的蒸汽上升管上升，在冷凝管冷却为液体，滴入滤纸筒中，对药材进行浸泡提取，当提取器内溶剂液面高度超过虹吸管高度时，由于虹吸作用，使提取器内的提取液（含成分）全部虹吸流入烧瓶中；烧瓶内的溶剂受热部分气化（化学成分仍留在烧瓶中），沿蒸气上升管上升重复上述提取，如此反复多次，直至药材中的成分提取完全为止。本法由于药材不断接触新溶剂，能始终保持较高的浓度差，所以提取比较完全。索氏提取器样品虹吸管滤纸套筒蒸汽上升管冷凝索氏提取器样品虹吸管滤纸套筒蒸汽上升管冷凝2）适用范围：适用于脂溶性较强的天然药物化学成分的提取。药量少时用此法提取。3）特点：提取效率高，溶剂用量少，但提取时间长，受热破坏成分不能用此法。4）提示：为了防止长时间受热成分被破坏，可在1～2小时后更换新溶剂继续提取。大量生产所用其他各种连续回流提取器的原理与索氏提取器相同。浸渍法渗滤法煎煮法回流提取法连续回流提取法溶剂提取法传统的提取方法总结现代的提取方法提取超声提取法ASE超临界流体萃取法超声提取法：利用超声波浸提有效成分的方法。原理：利用超声波的空化作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂易于渗入细胞内，同时超声波的强烈振动能传递巨大能量给浸提的药材和溶剂，使它们作高速运动，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出，极大的提高提取效率。1）操作技术：将药材粉末置适宜容器内，加入定量溶剂，密闭后置超声提取器内，选择适量超声频率提取一段时间后即得。2）适用范围：适用于遇热不稳定的提取。3）特点：优点为提取时间短，提取效率高，无需加热等优点。超临界提取法（SFE）概念：利用超临界流体代替有机溶剂提取有效成分的方法。任何一种物质都存在气相、液相和固相三种相态。三相平衡态共存的点称三相点。液、气两相成平衡状态的点称临界点。在临界点时的温度和压力称为临界温度(Tc)和临界压力(Pc)。高于临界温度和压力而接近临界点的状态称为超临界状态。处于超临界状态的流体称为超临界流体(SF)。超临界流体的特点：具有气液两相的双重特性，在超临界状态时具有高密度、低黏度、扩散系数比液体大100倍左右，因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力。物质不同，其临界点所要求的压力和温度也各不相同。SF具有选择性溶解物质的能力随超临界条件(温度、压力)的改变而改变。SF在超临界状态下与待分离的物质接触，使其选择性地溶解其中的某些成分。注意：由于SF的密度和介电常数随着密闭体系中压力的增加而增高，因此利用程序升压可将不同极性成分进行分步提取。对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以通过控制条件得到最佳比例的混合成分。基本原理：通过控制温度或压力，引起SF独特的物理化学性质的显著变化，从而引起待萃取物质的溶解度发生变化达到萃取的目的。然后经过减压、升温或吸附的方法使SF变成普通的气体，让被萃取的物质分离析出，以达到分离提纯的目的。

控温面板高压泵超临界CO2萃取实验装置示意图原料萃取柱玻璃珠脱脂棉超临界萃取实验装置与实验方法CO2钢瓶PCO2冷温槽恒温箱流量计接收瓶小试实验装置图实验装置组分减压阀适用范围：挥发性成分、脂溶性成分、高热敏性及易氧化分解成分的提取。

特点：易于操作，可调节范围广，选择性和溶解性好，通过调节压力、温度，可改变流体的极性和密度，使萃取成分易于富集，无溶剂残留，产品纯度高，萃取速度快，从萃取到分离全步完成。与GC、IR、MS等联用可快速有效地对天然物质进行提取、分离和测定，实现提取与质量分析一体化。提示：对极性大或分子量大的成分萃取较难，需加入与溶剂亲和力大的夹带剂（如水、乙醇、甲烷、戊醇等）以提高溶解度，或需要在很高的压力下进行提取，设备要求较高，应用有局限。水蒸气蒸馏法装置：一是水蒸气蒸馏装置，二是共水蒸馏装置。操作技术：将药材粗粉置于蒸馏烧瓶中，加水使药材充分浸润，体积不超过容器容积的2/3，然后通入水蒸气进行蒸馏。药材中的挥发性成分随水蒸气被蒸馏带出，经冷凝后，收集于接收瓶中，至馏出液由浑浊变澄清透明即蒸馏完全。适用范围：即适用于提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏不被破坏，不溶或难溶于水，与水不发生化学反应成分的提取。天然药物中主要用于挥发油、某些挥发性生物碱、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元的提取。4.接收器1.水蒸汽发生器2.蒸馏瓶3.冷凝管仪器装置特点：工艺简单，操作简便，实用性强，不需特殊设备，易推广。提示：蒸馏过程中需保温，蒸馏完成后应先打开三通管，使与大气压相通后再关火源或电源，以免发生倒吸现象。对于某些在水中溶解度稍大的成分，可加适量无机盐盐析或再蒸馏一次，以提高收得率和纯度。

提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。药材+水冷凝挥发油测定适用范围：挥发性成分、脂溶性成分、高热敏性及易氧化分解成分的提取。

特点：易于操作，可调节范围广，选择性和溶解性好，通过调节压力、温度，可改变流体的极性和密度，使萃取成分易于富集，无溶剂残留，产品纯度高，萃取速度快，从萃取到分离全步完成。与GC、IR、MS等联用可快速有效地对天然物质进行提取、分离和测定，实现提取与质量分析一体化。提示：对极性大或分子量大的成分萃取较难，需加入与溶剂亲和力大的夹带剂（如水、乙醇、甲烷、戊醇等）以提高溶解度，或需要在很高的压力下进行提取，设备要求较高，应用有局限。升华法原理：利用化合物的升华性进行提取。升华：天然药物中的某些固体成分在受热低于其熔点的温度下，不经液态直接成为气态，经冷却后又成为固态，从而与天然药物组织分离的性质提取有效成分的方法。

操作技术：药材粉碎后置于升华器皿中铺均匀，在容器上面放一冷凝器，加热升华器皿，使被提取物质升华，升华物经冷凝后析出于冷凝器底部表面即得。适用范围：适用于有升华性的某些生物碱类、香豆素类、羟基蒽醌类、有机酸类的提取。特点：操作时间长，温度较高，成分损失较大，药材易炭化产生的焦油状物质难以除去，有时还会有成分分解等。提示：本法由于升华不完全，效率低，有时还伴随成分的分解现象等缺点，故较少采用。实验室中主要用于有效成分的纯化和鉴定。什么是ASE？定义原理特点应用应用领域宽、速度快、使用溶剂少可用各种不同极性的溶剂10g样品仅用15mL溶剂，仅约15min提取（AcceleratedSolventExtraction）加速溶剂萃取的缩写是用溶剂对固体、半固体的样品进行提取的技术选择合适的溶剂、并增加溶剂的温度（40℃~200℃）和压力（1500psi）来提高提取过程的效率索氏提取、超声提取、微波提取、超临界提取、煮沸、手工振摇等传统提取方法所适用的领域ASE复习思考题1.什么是溶剂提取法？2.影响溶剂提取法提取的因素有哪些？3.化合物的极性与哪些因素有关？4、用溶剂提取法提取天然药物中的化学成分时常用的提取技术有哪些？5、水蒸气蒸馏法和超临界流体萃取法的适用范围分别是哪些？本章内容

第一节提取方法和技术第二节分离精制和鉴定的方法与技术

第二节分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法学习目标：1熟悉系统溶剂分离法的原理、特点及适用范围2掌握简单萃取法、沉淀法、结晶法的原理、特点及适用范围3熟悉透析法、分馏法的原理、特点及适用范围

一、系统溶剂分离法是一种按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次分离提取液中的各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分离的方法。操作技术：提取液适当浓缩，或拌入适量随性吸附剂如粗硅胶、纤维素粉、硅藻土等，低温或自然干燥后，依次选用3～7种不同极性的溶剂（石油醚或苯、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水），由低极性至高极性分步对总提取物进行提取分离。因总提取物中各类成分的极性不同，可被相应极性的溶剂所分离。也可以选择其中的三、四种不同极性的溶剂组成溶剂系统，按极性由低到高分步进行抽提，分成若干部位。

适用范围：适用于有效成分尚未明确的天然药物提取液的分离。特点：操作繁琐，相同成分会分散在不同的抽提部位，不易收集。微量成分、结构相似成分的纯化分离受限制。提示：在研究不明成分中最为常用。天然药物成分极性天然药物成分类型适用的提取溶剂强亲脂性 挥发油,脂肪油,蜡,甾醇类,石油醚,已烷脂溶性色素,某些苷元 亲脂性 苷元,生物碱,树脂,醛,酮,乙醚,氯仿醇,酯,有机酸,某些苷类 中等极性 某些苷类（如强心苷等） 氯仿:乙醇(2:1)

某些苷类（如黄酮苷等）乙酸乙酯 某些苷类（如皂苷、蒽醌苷等）正丁醇亲水性 极性很大的苷,糖类,丙酮,乙醇,甲醇氨基酸,某些生物碱盐 强亲水性 蛋白质,黏液质,果胶,糖类,水氨基酸,无机盐类 二、两相溶剂萃取法(液-液萃取法、萃取法）1概念：是指在提取液中加入一种与其不相混溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分在两相溶剂中分配系数不同而将所需成分萃取出来的分离方法。

2基本原理：利用混合物中各成分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。分配系数***：是指在一定温度和压力下，某物质溶解在两种不相混溶的溶剂中，当达到动态平衡时，根据分配定律，该物质在两相溶剂中浓度的比值为一常数，称为分配系数（K），即：K=C上

/C下实验室液液萃取过程两相溶剂萃取法两相溶剂萃取法的“两相”一般是指互相饱和的水相与亲脂性有机溶剂相，混合物中各成分在两相溶剂中分配系数差别越大，则越容易分离，分离效果越高。3萃取溶剂的选择萃取溶剂的选择应遵循下列原则：(1)萃取溶剂应与原溶剂不相混溶或仅能部分混溶，振摇、静置后，应能较好地分层。(2)有效成分(或杂质)在萃取溶剂中应有较大的溶解度，而杂质（或有效成分）在萃取溶剂中的溶解度要小，即二者的分配系数应有一定的差别，差别越大越容易分离。注：两相溶剂的极性应有一定差异，极性差别太小或太大，分离效果都不好。酸、碱性成分常用pH梯度萃取法分离。

pH梯度萃取法（梯度调节pH，每次改变一种成分的存在状态，依次分离）利用混合物中各成分酸(或碱)性强弱不同，相应改变溶液pH值使成分相继成盐或游离，改变其在溶剂系统中的分配系数而与其他成分达到分离的方法。如：黄酮苷元的分离。利用黄酮类化合物酸性强弱不同，先将其苷元溶于有机溶剂，然后依次用pH值由低到高的碱液萃取，使黄酮类成分与碱成盐后被依次萃取而分离。又如：生物碱的分离。生物碱多具有碱性，可用酸水进行提取，然后用pH由低到高的碱调节溶液pH值，使生物碱按碱性强弱不同依次游离，再用有机溶剂依次进行萃取而达分离。举例药材+酸水溶液酸水提取液生物碱盐生物碱具有亲脂性，不溶或难溶于水，可溶于有机溶剂。因结构中含有氮原子，具有碱性，提取时常用酸水为溶剂进行，酸水提取液碱化后，用有机溶剂进行萃取，从而与水溶性杂质达到分离。用碱水调节溶液pH值至碱性(碱化),使生物碱转为游离状态后再用氯仿等有机溶剂进行萃取。水溶性杂质（留在水中）举例特点：操作简便，设备简单，实验室常用。但溶剂用量大、易乳化。适用范围：适用于分配系数差异较大成分的分离。(一)简单萃取法

(分次萃取)：是常用的一种萃取方法，小量萃取可使用分液漏斗进行。萃取技术操作流程：操作中应注意检漏、排气、振摇、静置等过程。分离液层时，先打开玻塞，下层液体应经活塞放出，关闭活塞，上层液体应从上口倒出，重复萃取数次，合并萃取液，加入适量的干燥剂进行干燥，后置于蒸馏瓶蒸去溶剂，即得萃取产物。提示：①若分离水提取液中的成分，则水提取液浓度不可过稀或过浓。过稀，萃取溶剂用量过大；过浓，两相溶剂不易充分接触，影响萃取效果。一般水提取液比重在1.1～1.2之间为宜；②萃取溶剂与提取液应保持一定比例，第一次萃取一般为提取液的1/3～1/2，以后用量为1/6～1/4；③分配系数差别较大时，一般萃取3～4次即可。若亲水性成分不易转入有机溶剂层时，需要增加萃取的次数或更换新的萃取溶剂；④防止乳化。碱性水提取液，用氯仿萃取时，易发生乳化现象，萃取时应尽量防止乳化，如：采用旋转混合方式，避免强烈振摇，或改用氯仿和乙醚混合溶剂作萃取剂，或延长萃取时间等。

⑤若已经形成乳化层，采用破乳措施：较长时间放置；轻度乳化可用细金属丝或细玻棒在乳化层中搅动；加入食盐饱和水溶液，增加水的密度；滴入数滴戊醇,改变其表面张力，使乳化层破坏；乳化严重时可分出乳化层，用加热、冷冻、将乳化层抽滤或更换新溶剂进行萃取等方法处理；根据实际情况不同，还可以加入其他破坏乳化的物质，如乙醇、磺化蓖麻油等。⑥中量萃取可使用下口瓶，工业生产上大量萃取可在密闭的萃取罐内进行。(二)逆流连续萃取法逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。是利用两相溶剂密度不同，即相对密度小的作为分散相（流动相）逆流连续穿过相对密度大的固定相，在相对运动中,使提取液中的不同成分因分配系数差异分溶于两相溶剂中而达到分离。操作技术：逆流连续萃取装置是用一根或数根萃取管串联制成。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。装置见图：例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素将氯仿（固定相）装于萃取管内，开启活塞，则水（流动相）提取液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大、萃取就比较完全。如果用的是比水轻的溶剂如苯、乙酸乙酯等进行萃取，则水提取需装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取过程中可用薄层色谱、纸色谱及显色反应或沉淀反应随时检查萃取是否完全。适用范围：各种密度的溶剂萃取。特点：操作简便，萃取较完全。提示：可以避免乳化现象产生。举例(三)逆流分溶法（CCD)：是一种在加样量一定，容量也一定的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而使混合物中的各种成分分离的方法。也称逆流分配、逆流分布或反流分布法等。适用范围：中等极性、分离因子较小（β＜50）及不稳定的物质。工作原理：多次、连续的液液萃取特点：避免手工操作，分离效率高，操作条件温和，试样回收容易。但溶剂用量大，机械操作导致破损、漏液、易乳化。提示：混合物各成分的分配系数很接近时，一般方法不易分离时可用此法。但操作繁琐，消耗溶剂多，含量微小的成分易损失于大体积的溶液中，易乳化等，极性过大或过小的成分，或分配系数受温度或浓度影响过大及易乳化的溶剂系统均不宜采用此法。

(四)液滴逆流分配法(DCCC)：是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。可有效防止乳化现象的产生。流动相液滴垂直上下，经过固定相液体操作技术：装置：分为三个部分。微型泵、移动相溶液贮槽和试样液注入品组成输液部分；第二部分由300-500根内径约2mm、长度为20-40cm的萃取管连接而成；第三部分由检出器和分步自动收集仪组成。操作：先将选择好的两相溶剂中的固定相充入全部萃取管内，然后从加样口注入已溶于（1:1）两相溶剂中的待分离试样，再由微型泵注入移动相，移动相在萃取管中形成液滴，不断地与固定相有效地接触、摩擦形成新的表面，促使演技在两相溶剂中实现充分的分配，获得很高的分离效果。不易乳化或产生泡沫，若用氮气驱动流动相，可避免被分离成分的氧化。从萃取管中流出的移动相通过检出器进行分部收集，完成液滴逆流分配的全过程。适用范围：皂苷类化学成分的分离。特点：使用溶剂较少，可定量回收试样，分离效果比CCD法好。提示：广泛用于分离纯化多种天然药物化学成分，如：皂苷、生物碱、蛋白质、多肽、酸性成分及糖类等。分离效果好！三、沉淀法：沉淀法：指在提取液中加入某些试剂，使某些成分产生沉淀，而其他成分可以溶解、滤过，将所需的成分沉淀出来，从而达到分离的目的。（一）酸碱沉淀法：利用某些成分在酸、碱溶液中的溶解度不同而分离。（含生物碱或内酯）原料用（酸或碱）水提取再加碱或酸（使游离或成环）使沉淀析出（生物碱或内酯化合物）分为：酸溶碱沉法、碱溶酸沉法

四、结晶法结晶法：是利用混合物中各成分在某种溶剂中溶解度的差异，使某单一成分以结晶状态析出而与其他成分分离的一种方法。1结晶和重结晶概念结晶：是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。重结晶：指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作过程。原理：根据混合物中各成分在某种溶剂中溶解度的差异。先加热溶液，蒸发溶剂成饱和溶液，此时降低热饱和溶液的温度，溶解度随温度变化较大的溶质就会呈晶体析出。

结晶溶剂的选择关键溶剂应符合下列条件：①不与有效成分发生化学反应。②对欲结晶的成分在热时溶解度大，冷时溶解度小，差别越大越好。③对可能存在的杂质冷热时溶解度均大，这样当溶液放冷时，有效成分析出结晶，而杂质仍留在母液中；或杂质在冷热时溶解度均极小，可先滤过除去。④有一定的挥发性，沸点不宜过高或过低。过高时，附着于结晶表面的溶剂不易除去；过低时，则有效成分溶解度冷热时变化不大，不利于结晶。常用的溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯、石油醚等。使用乙醚时应注意乙醚易燃，且易沿瓶壁爬行挥发，而使结晶析出于瓶壁上，影响结晶的纯度。操作：(1)制备结晶溶液(2)趁热过滤，除去不溶性杂质(3)将滤液放冷，使析出结晶(4)抽气过滤，将结晶从母液中分出(5)重结晶(6)晶体的干燥结晶和重结晶操作：

提取或分离物

↓溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤溶液

↓放置（冷藏）析晶，过滤粗结晶

↓重复上述操作（重结晶）结晶适用范围：分离纯化固体化学成分。特点：分离纯化固体成分的重要方法之一，可获得较纯单体。提示：结晶溶剂的选择是结晶法成败的关键；注意影响结晶的其他条件。影响结晶的因素：(1)结晶溶剂的选择是最重要因素之一，应符合一定条件。(2)杂质的存在会影响结晶的形成，应尽可能除去。(3)有效成分的含量高时容易形成结晶，溶液应尽可能纯化。(4)溶液浓度：应考虑溶液的浓度高是有效成分含量高还是杂质较多。一般地，溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多；反之，结晶慢，但晶形大、纯度高。(5)结晶温度和时间：温度低、时间长，结晶较好。(6)被结晶成分的类型：分子小易结晶；分子大、含糖多，不易结晶。故：在制备结晶时，一般是用较稀溶液在较低温度下长时间放置，使其缓慢析出结晶，这样形成的晶体大而且纯。促使结晶形成的方法：用玻棒摩擦容器壁；加入晶种（同型化合物的微小颗粒）；

1、怎样选择结晶所用的溶剂？2、当结晶不易析出时应采取什么措施？3.什么是重结晶？4.结晶的操作包括哪些步骤？

课堂活动五、透析法透析法：是利用透析膜的选择性透过作用，提取液中的小分子物质可通过半透膜，而大分子物质不能通过的性质，使分子量差异较大的物质达到分离的方法。1操作技术：实验室操作常用市售的玻璃纸或动物半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，将欲透析的样品液小心加入半透膜袋内，悬挂在清水容器中。透析过程中需要经常更换清水，使透析膜内外溶液的浓度加大，以加快透析速度。透析法分离的速度较慢，为了加快透析速度，可采用电透析法，电透析法可使带电离子的透析速度增加10倍以上。透析法示意图：

2适用范围：适用于分离纯化蛋白质、多肽、多糖、皂苷等分子量较大的成分时，常采用本法除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。反之，如果杂质是大分子的蛋白质、淀粉、树脂等，采用此法将其留在半透膜内，而将所要的小分子成分通过半透膜进入膜外溶液中，从而加以分离精制。3特点：操作简便，分离完全。4提示：透析膜有多种规格，需根据欲分离成分的分子量大小来选择。透析是否成功与透析膜的规格关系很大。常用的透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白胶膜及玻璃纸膜等。六、分馏法分馏法：是利用混合物中各成分的沸点不同，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，收集不同温度的馏份，借以分离液体混合物的一种方法。在天然产物有效成分研究中，挥发油及一些液体生物碱常用此法分离。分馏法是将多次蒸馏的复杂操作集中在一支分馏柱中完成。1操作技术：操作时将待分馏样品放入圆底烧瓶中，加入沸石，安装好装置，在分馏柱的外围尽量用石棉绳包住，选择合适的热浴加热。当瓶内深一开始沸腾时，就要注意调节温度，使蒸气缓慢升入分馏柱。当蒸气走入分馏柱时，由于柱外空气的冷却，部分蒸气凝成液体，高沸点的组分较易被冷凝，随着分馏柱管的升高，愈向上混合蒸气中所含高沸点成分的组分越少，到一定高度时，可获得某一纯的组分。待低沸点组分蒸馏完后，再逐渐升高温度，如此进行操作，使不同沸点的组分逐一分馏出来。2适用范围：适用于分离天然药物中沸点差异较小的液体混合物，如挥发油、液体生物碱等。3特点：操作简便，但加热时可能会破坏某些成分。4提示：注意保持柱内适当的温度梯度，一般用石棉进行保温，严格控制热源的温度。第二节分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法学习目标：掌握薄层色谱法、纸色谱法的概念；分离原理和操作技术。2.熟悉比移值的计算方法。3.了解高效液相色谱法和气相色谱法的应用和适用范围

。1.概念：色谱法又称层析法利用混合物中各成分的物理和化学性质差异，使各成分得到分离的一种方法。广泛地应用于天然药物化学成分的分离、纯化和鉴定。结构类似的化合物的分离，效果良好。分离、分析的重要工具！2基本原理利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的差异而达分离。七、色谱法色谱分离法命名：分离方法为“色谱法”玻璃管称：“色谱柱”碳酸钙称：“固定相”石油醚称：“流动相”植物色素分离图示3

分类：(1)按移动相状态不同分类：

液-固色谱①液相色谱液-液色谱气-固色谱（GSC）很少应用②气相色谱气-液色谱（GLC）(2)按原理分类

①吸附色谱

②分配色谱

③离子交换色谱（IEC）

④凝胶色谱（GFC）

(3)按操作形式的不同分类①柱色谱（吸附柱色谱LSC、分配柱色谱LLC）②纸色谱（PC）③薄层色谱（TLC）4应用按被分离成分性质和各色谱法的特点进行选择。(一)柱色谱法柱色谱法（columnchromatography）：常用,也是色谱法最早出现的形式。它将分离材料均匀地加入到一定规格的玻璃柱中，再以适当的洗脱剂进行洗脱，使结构性质不同的成分达到分离。特点：分离样品量大，多为制备性分离。分类：按分离机理不同可分为吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等。1吸附柱色谱法吸附柱色谱法是一种在柱状容器中，利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的差异而进行分离的方法。(1)基本原理利用吸附剂对混合物中各成分的吸附能力的差异，以及流动相对各成分解吸附能力的差异，而使各成分得以分离。过程：当流动相流过吸附剂时，各成分在吸附剂和流动相之间连续地发生“吸附、解吸附、再吸附、再解吸附”。被吸附剂吸附力大的成分难被流动相解吸附，迁移速度慢,而被吸附剂吸附力小的成分易被流动相解吸附，迁移速度快，最后，由于各成分的迁移速度不同而达到分离。(2)吸附剂吸附剂是吸附色谱法中的固定相，在吸附色谱中的重要因素。吸附剂应具备的条件：①吸附剂应具有较大的表面积和足够的吸附能力，颗粒要均匀，具有一定的细度；②不与流动相、溶剂及样品中各成分发生化学反应；③在流动相及所用的溶剂中不溶解。吸附剂对成分的吸附作用可分为：化学吸附、半化学吸附和物理吸附。化学吸附：具有选择性，吸附剂与成分之间吸附能力强，难洗脱。如用酸性硅胶分离生物碱和用碱性氧化铝分离酸性的黄酮等，分离时应尽量避免使用。半化学吸附：介于化学吸附与物理吸附之间，有一定的选择性，如聚酰胺与黄酮类化合物的氢键吸附，结合力较弱，过程可逆，可以使用。物理吸附：是一种表面吸附，无选择性，过程可逆，吸附强弱及物质的迁移速度与成分的极性有关，遵循“相似者易吸附”的原则，是主要的分离方式。吸附剂的吸附能力与吸附剂本身的性质、有效表面和含水量有关。吸附剂按其本身的性质可分为两大类：

极性吸附剂****：对极性大的成分吸附能力强，吸附剂如：硅胶,氧化铝等。非极性吸附：对非极性成分吸附能力强，如：活性炭。常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、聚酰胺和活性炭等。1）硅胶硅胶是一种弱酸性*吸附剂。用SiO2•XH2O表示，是多孔性物质，分子表面有很多硅醇基，能通过氢键吸附水分。其吸附作用是由硅醇基产生的，吸附作用的强弱与游离硅醇基数目有关。被分离成分因极性和不饱和程度不同，与硅醇基相互作用的程度也不同，因而得以分离。硅胶的分离效率与其粒度、孔径和表面积有关。硅胶的粒度越小，均匀性越好，分离效率越高；硅胶的表面积越大，与样品相互作用越强，吸附力越强。此外，还与其含水量有关。硅胶分子中硅醇基通过氢键吸附水分达到饱和（当含水量达17％以上）时，硅胶便失去了吸附活性，不能再作吸附剂，但可作分配色谱中的支持剂。若用加热方法除去硅醇基上的水分，可使硅胶恢复吸附力。活化：是加热除去吸附剂中部分水分，使其吸附力增强的过程称为活化。硅胶活化：100～110℃，30min当温度升高至500℃时，由于硅胶结构内的水（结构水）不可逆地失去，使表面硅醇基也脱水缩合转为硅氧烷醚结构，从而导致其吸附能力显著下降，不再有吸附剂的性质，再用水处理也不能恢复其吸附性，因此，硅胶的活化不宜在较高温度下进行。适用范围：硅胶为酸性吸附剂，适用于中性和酸性成分的分离。样品与硅胶用量比：一般为1:30～1:60,对较难分离者，可用到1:500～1:1000。市售硅胶的型号：硅胶G（含有煅石膏14～22％）、硅胶或硅胶H（既不含黏合剂，也不含荧光物质）、硅胶S（含有淀粉）、硅胶F（是在吸附剂中加入有254nm或365nm波长下能发生荧光的物质），如硅胶F254或硅胶F365。2）氧化铝

色谱用的氧化铝是由氢氧化铝在400～500℃灼烧而成，因制备和处理方法的差异，可分为碱性、中性和酸性3种。氧化铝是极强的亲水性吸附剂，其中又以碱性氧化铝吸附力最强,其活性也和含水量有关，含水量愈多、吸附能力愈弱。①碱性氧化铝（pH9～10）适于生物碱，甾醇类等碱性或中性成分的分离。碱性氧化铝有时会与醛、酮、酯和内酯类成分发生异构化、氧化和消除化反应。故不宜用于醛、酮、酯和内酯类成分的分离。②中性氧化铝（pH6.5～7.5），主要适用于萜、醛、酮、皂苷等中性或对酸碱不稳定的成分的分离。③酸性氧化铝（pH4～5）适用于有机酸、氨基酸等酸性成分以及对酸稳定的中性成分的分离。样品与氧化铝用量比：在1:20～1:50之间，极性弱的碳氢化合物，可增至1:100～1:200。粒度要求：柱色谱用的氧化铝，其粒度要求在100～160目之间。市售规格：氧化铝因黏合剂或荧光剂不同可分为氧化铝或氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF254、氧化铝GF365等不同类型。

氧化铝、硅胶活度与含水量关系

3）聚酰胺聚酰胺：又称绵纶、尼龙，是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。种类较多，色谱常用聚已内酰胺（绵纶6）难溶于水及乙醇,可溶于浓盐酸和甲酸。其结构式为：

影响聚酰胺与被分离成分形成氢键的因素有：①被分离成分的结构化合物分子能形成氢键的基团（如酚羟基、羧基、醌基等）越多，则被聚酰胺吸附越强，洗脱时越难洗脱。如：

与形成氢键的基团所处位置不同，其被吸附的强度也不同。一般对位、间位酚羟基被吸附的强度要大于邻位酚羟基。分子内芳香化程度越高、共扼双键越多,则被吸附性越强，如：

能形成分子内氢键者被吸附强度小，如：

②溶剂的种类聚酰胺与各种成分一般在水中形成氢键缔合能力较强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力，由弱至强的顺序**为：水<

甲醇或乙醇(浓度由低至高)<丙酮<

稀氢氧化钠水溶液或稀氨溶液

<

甲酰胺<甲基甲酰胺<

尿素水溶液4）活性炭活性炭：非极性吸附剂，有较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。可分三类：①粉末状活性炭颗粒极细、呈粉末状，比表面积大，故吸附力及吸附容量也大，是活性炭中吸附力最强的一类。但在柱色谱过程中流速较慢，需加压或减压操作。常需加入适量硅藻土作助溶剂一并装柱，以免流速太慢。②颗粒状活性炭颗粒较前者大，比表面积则相应减少,吸附力和吸附容量也均小于前者，但在色谱过程中流速较快易于控制，是色谱最常选用的活性炭。③锦纶活性炭以锦纶为黏合剂，将粉末状活性炭制成粒状活性炭。比表面积介于上述二者之间，吸附力比两者皆弱。用于分离酸性和碱性氨基酸效果良好。适用范围：活性炭柱色谱主要用于分离氨基酸、糖类及某些苷类等水溶性成分。活性炭对不同物质的吸附力也不一样。对极性基团多的化合物吸附力大，而对极性基团少的化合物则吸附力小；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如对多糖的吸附力大于对单糖的吸附力；对羟基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸的吸附力。可利用活性炭对上述几类化合物吸附力差别而将它们分开。活性炭在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱。故：水洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强，碱性溶剂的洗脱能力最强。(3)移动相（洗脱剂、展开剂）习惯上将柱色谱所用的溶剂称洗脱剂，用于薄层色谱或纸色谱的溶剂称展开剂。用吸附色谱法分离混合物时，移动相的选择对分离效果影响极大。移动相应该具备以下条件***：①具备较高纯度，不含水分；②与样品、吸附剂不发生化学反应；③对被分离成分有一定的溶解度；④黏度小；⑤易挥散等。

洗脱剂的选择应根据被分离物质的极性和吸附剂的性质综合考虑。分离极性强的成分，宜选用极性溶剂为洗脱剂；分离极性弱的成分，宜选用弱极性溶剂为洗脱剂。中等极性成分则选用中间条件进行分离。一般地，溶剂极性与其洗脱能力成正比。常用单一溶剂的极性顺序为：石油醚<

环已烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<

甲苯<

二氯甲烷<

氯仿<

乙醚<

乙酸乙酯<

正丁醇<丙酮<

乙醇<

甲醇<

吡啶<

酸<

水。单一溶剂为洗脱剂，分离重现性好，组成简单，但往往分离效果不佳。故在实际工作中常采用二元、三元或多元溶剂系统作洗脱剂。洗脱时应该由小极性溶剂开始，逐渐增大洗脱剂的极性。如果极性增大过快，往往不亦获得满意的分离效果。(4)被分离成分

吸附色谱的三要素：被分离成分、吸附剂和洗脱剂共同构成。在吸附剂与洗脱剂已定情况下，各成分的分离直接与被分离成分的结构和性质有关。对硅胶、氧化铝等极性吸附剂来说，被分离成分的极性越大，被吸附剂吸附就越牢固，洗脱就越困难。化学成分的极性大小，与成分的结构有关。①化合物分子母核大小和碳链的长短：分子大、碳原子数多，极性小，被极性吸附剂吸附不牢固，容易洗脱；分子小、碳原子数少，极性大，被极性吸附剂吸附牢固，不易洗脱。②取代基极性大小：当母核相同或相近时，成分的极性小主要取决于取代基极性。取代基极性越大或极性取代基数目越多，成分的极性也越大。常见基团极性大小顺序如下：－CH3，－CH2－＜－CH＝CH－＜－OCH3，－O－CH2－＜－NO2＜－N(CH3)2＜－COOR＜C=O＜－CHO＜－SH＜－NH2＜－NH－＜－COCH3＜－OH＜Ar－OH＜－COOH

③结构中双键或共轭双键数目增加，化合物极性增大。被分离成分结构不同其极性也不相同，只要极性有差别就有可能获得分离，关键在于条件的选择：要根据被分离成分的极性来选择吸附剂与洗脱剂*。在实际工作中常常是在吸附剂和固定相已确定的情况下，根据各成分的极性来判断它们迁移速度（即Rf值）的大小。在吸附剂、移动相和温度等色谱条件一定的情况下，根据不同成分的迁移速度不同、同种成分的迁移速度相同这一性质，可以对化学成分进行分离和定性鉴别。色谱三要素之间存在以下关系：

(5)操作技术1)选择色谱柱内径与柱长比一般用1:15～1:20之间。难分离成分可适当增加柱长。2)装柱①测定吸附剂的活度。②粒度：用前过筛，一般在100～160目。③用量比：多为1:30～1:60，对难分离成分增加用量比至1:100～1:200。④装柱方法：有干法装柱和湿法装柱两种方法。3)上样（样品上柱、加样）①湿法上样：易溶于洗脱的成分用此法上样。②干法上样：不易溶于洗脱剂的成分应先用甲醇、丙酮等低沸点溶剂先溶解后，加用少量吸附剂拌匀，蒸干、研细、加至吸附剂顶端。4)洗脱①梯度洗脱（溶剂极性由小至大）使成分分离。洗脱时注意控制流速（柱长为40cm时，约3～4ml/min）。②洗脱液收集一般地，吸附剂用50g,每份收集约50ml；如被分离成分结构相似或洗脱剂极性大时，每份收集液量应减少。③检测。（5）特点①硅胶为酸性、亲水性吸附剂，具有吸附容量大，机械强度好，分离范围广等优点被广泛使用，但不宜用于碱性成分的分离。②氧化铝具有分离效果好，再生容易，对杂质的吸附能力及分离样品的用量比硅胶大等优点，但与某些酸性、酚性物质及色素等成分可发生异构化、氧化和消除等次级反应，故对醛、酮、酯、内酯等成分的分离不宜使用。③活性炭价廉易得，样品上柱量大，分离效果好。④聚酰胺在分子表面及其内部均可形成氢键吸附，具有吸附容量大，分离效果好的优点。（6）适用范围①硅胶适用于酸性或中性亲脂性成分的分离；②氧化铝适用于碱性或中性亲脂性成分的分离；③活性炭适用于亲水性成分的分离；④聚酰胺适用于黄酮、蒽醌、酚类成分的分离及粗提取物中鞣质的除去。(7)提示①硅胶有时具有吸附和分配的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用；②由于目前尚无活性炭吸附活度级别测定的理想方法，其吸附力不易控制，故具体应用有一定限制；③聚酰胺分离成分的容量较大，分离时吸附剂与样品的用量比多为1:10～1:20；如果洗脱剂为含水溶剂系统，则用水装柱，用水、从稀至浓的乙醇液（10%、30%、50%、75%、95%）依次洗脱；如果洗脱剂为非极性溶剂系统，则以系统中极性较低的溶剂装柱；如果以三氯甲烷装柱，上样时先放出底层的三氯甲烷后，立即加样，然后用一层脱脂棉或玻璃珠压紧柱顶；如果操作中需要关闭活塞，则应放出顶层的三氯甲烷，以防聚酰胺浮起扰乱色带。2分配柱色谱法分配色谱是在柱状容器中，利用被分离成分在固定相和流动相两相间的分配系数不同进行分离的色谱方法。(1)基本原理由于各成分在固定相(液)和流动相(液)中的分配系数不同,当流动相流经固定相时，各成分就在两相之间连续不断地发生“分配”，易溶于流动相中的成分(在流动相中分配的多)，移行快；易溶于固定相中的成分(在固定相中分配的多)，移行慢。

(2)支持剂支持剂又称载体、担体。作为分配色谱的支持剂应为中性多孔的粉末，无吸附作用，不溶于两相溶剂中，与被分离的物质不发生化学反应，并能吸着一定量的固定相，流动相能自由通过而不改变其组成。常用的载体有：①硅胶含水量17%以上的硅胶已失去吸附性，可作为载体。硅胶可吸收其本身重量的50%的水分，而不显湿状。②硅藻土是现在应用最多且效果很好的一种载体。可吸收相当于自身重量的100%的水分。③色谱滤纸或纤维素粉

是一种常用的支持剂，靠滤纸上的纤维素可吸收自身重量100%的水分。反相分配色谱多采用碳十八烷基(-C18H37)、辛基(-C8H17）或乙基（-C2H5）键合硅胶作固定相。

正相分配色谱固定相：常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、甲醇、甲酰胺等；流动相：用与水不相混溶（或很少混溶）的有机溶剂，如石油醚、苯、丁醇、戊醇等。适用范围：分离亲水性成分和弱亲脂性成分。反相分配色谱固定相：用与水不相混溶（或很少混溶）的有机溶剂，如石油醚、苯、丁醇、戊醇等；流动相：常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、甲醇、甲酰胺等。适用范围：分离强亲脂性成分时,须采用反相分配色谱法。（3）溶剂系统分配色谱中的固定相和移动相一般由二元或三元甚至三元以上溶剂按一定比例组成复合的两相溶剂系统。选择适当的溶剂系统可提高分离效率。一般用纸色谱法选择分离的条件，寻找合适的溶剂系统。

根据固定相与流动相的相对极性大小，分配色谱可分为正相分配色谱和反相分配色谱。

（4）被分离成分一般在正相色谱中，因移动相极性比固定相小，被分离成分中极性较小的的成分迁移速度较快；在反相色谱中则相反。（5）操作技术1）装柱；2）加样；3）洗脱（6）特点应用广泛，分离效果好。（7）适用范围正相色谱法常用于分离极性较大的成分。反相色谱法主要用于亲脂性成分的分离，但分离效果不如吸附色谱。（8）提示操作前，必须使固定相和移动相预先饱和；使用过程中保持恒定温度；合理控制上样量。3离子交换色谱法以离子交换树脂为固定相，以水或含水溶剂为流动相，由于各成分与树脂的交换能力不同而分离。应用：酸性、碱性及两性基团，在水中多呈解离状的成分。（1）基本原理

离子交换树脂本身含有解离的阳离子或阴离子，可与水溶液中相同电荷的离子发生交换作用，而被吸附到柱上，再用适当流动相洗脱，即可分离混合物中离子型的化合物。阳离子交换树脂

阴离子交换树脂

式中R-H+、R+OH-分别代表阳离子和阴离子交换树脂，可交换的基团是H+

和OH-。

(2)离子交换树脂的类型

性质：离子交换树脂外观为球形颗粒，不溶于水，但可在水中膨胀。组成：离子交换树脂由树脂母核和离子交换基团。母核部分是苯乙烯通过二乙烯苯交链而成的大分子网状结构。网孔大小用交联度（即加入交联剂的百分数）表示。交联度越大，则网孔越小，质地越紧密，在水中不易膨胀；反之亦然。不同交联度适于分离不同大小的分子。根据离子交换树脂中交换离子的性质不同，离子交换树脂分两大类。1）阳离子（酸性）交换树脂含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。分为：强酸型：R-SO3H；中等酸型：R-COOH，R-PO3H2；弱酸型：R-SH。2）阴离子（碱性）交换树脂含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。分为：强碱型：R-NR1R2R3OH；弱碱型：R-NH3OH，R-NH2R-OH，R-NHR1R2OH；中等碱性主体结构上既结合有强碱型离子交换基团，又含有弱碱性离子交换基团。

离子交换树脂的交换能力（交换容量），取决于离子交换基团数量，其单位是毫摩尔/克（mmol/g）。强酸性阳离子交换树脂如强酸1×7，表示交联度为7%,其交换容量为4.5mmol/g，对分子量为166的麻黄碱来说，1g上述阳离子交换树脂，理论上应能交换166×4.5mg的麻黄碱。样品与树脂的用量比，需根据交换容量来计算，对阳离子交换树脂来说，样品的用量为总交换量的1/2；对阴离子交换树脂来说，样品用量为交换容量的1/4～1/3。(3)操作技术1）树脂的预处理：①溶胀②洗除杂质③树脂的转型2）上样3）洗脱4）再生(4)特点：应用范围广，树脂可反复使用。(5)适用范围：酸性、碱性或酸碱两性化合物的分离。(6)提示：试样的用量由所选择的树脂的交换容量决定，若用阳离子交换树脂，样品量可加至全交换容量的1/2，若使用阴离子交换树脂，样品量可加全交换容量的1/4～1/3。4凝胶滤过柱色谱法凝胶色谱法也称凝胶渗透色谱法、分子筛过滤色谱及排阻色谱法等。是以凝胶为固定相，选择适当溶剂进行洗脱，使混合物中分子量大小不同的物质分离的方法。（1）基本原理：分子筛原理凝胶是一种多孔性球形颗粒，具网状结构，不溶于水，但可在水中膨胀的高分子化合物。当凝胶用水膨胀装柱后，加样品入样品，用同一溶剂洗脱时，由于各种化合物的分子量不同，受凝胶网孔半径限制也不同，大分子不能渗入凝胶颗粒凝胶部，随溶剂在颗粒间移动先被洗脱；内小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部中，受到的阻力增大，流速减慢，故后被洗脱。这样混合物就按分子量由大到小先后流出而得到分离。(2)凝胶的类型

常用葡聚糖凝胶，由葡聚糖和交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成。凝胶颗粒网孔大小，取决于制备凝胶时所加交联剂的数量和反应条件，交联剂加入的越多，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀也越小；交联剂加入越少，网孔越大，吸水膨胀也越大。市售的凝胶型号是按交联度大小分类，并以吸水量多少表示。如：G-25，G为凝胶，后附的数字表示吸水量乘以10，即G-25表示此葡聚糖凝胶的吸水量为2.5ml/g。(3)操作技术1）凝胶的选择：根据实际工作需要选择2）凝胶的浸泡溶胀3）装柱4）上样5）洗脱6）再生

(4)特点设备简单，易于操作，分离效果好，但分离速度较慢。(5)适用范围分子量大小不同的化合物的分离。(6)提示

5大孔吸附树脂(1)结构与组成：大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒状，粒度多为20～60目。组成为苯乙烯，二乙烯苯，或а-甲基丙烯酸酯型。其中苯乙烯,二乙烯苯型为非极性树脂，2-甲基丙烯酸酯型为中极性树脂。大孔吸附树脂的结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构。(2)分离原理①吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。②筛选性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。(3)特性①理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂；②对有机物选择性较好；③吸附速度快；④再生处理方便。大孔树脂色谱法吸附原理——范德华引力＋分子筛大孔树脂具有吸附性及分子筛的双重作用，可分离天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分分离。

(4)影响大孔吸附树脂分离效果的因素①化合物分子极性大小：一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反相的性质。被分离物质的极性大先流出色谱柱。②分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。(5)洗脱剂对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对中极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大溶剂洗脱力强。一般上样后先用水(或酸、碱水)洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。

(二)薄层色谱法薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）是一种快速、简便、灵敏的分离检识方法。即将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量目的方法。该方法不仅对分离鉴定天然产物成分起到了独特的作用，在分析化学、药物化学、染料、农药等领域，均