第三章-基因工程的载体复习课程

第二章基因工程的载体(zàitǐ)和工具酶第一节载体(zàitǐ)第一页，共36页。引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：⑴载体必须是复制子。⑵具有合适的筛选标记，便于重组(zhònɡzǔ)子的筛选。⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。⑷自身分子量较小，拷贝数高。⑸在宿主细胞内稳定性高。第二页，共36页。一、质粒载体(zàitǐ)（plasimidvectors）（一）质粒载体(zàitǐ)的生物学特性（二）质粒载体(zàitǐ)的制备（三）质粒载体(zàitǐ)的改造第三页，共36页。（一）质粒的生物学特性(tèxìng)（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制(fùzhì)的裸露的双链环状(少数为线形和RNA）DNA分子。广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别(tèbié)是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。第四页，共36页。（一）质粒的生物学特性(tèxìng)（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞(xìbāo)中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞(xìbāo)中繁殖。第五页，共36页。（一）质粒的生物学特性(tèxìng)（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞(xìbāo)中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞(xìbāo)间和不同的生长环境也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞(xìbāo)中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。第六页，共36页。（一）质粒的生物学特性(tèxìng)⑹质粒的转移(zhuǎnyí)

接合型质粒分子量大严紧(yánjǐn)型复制

非接合型质粒分子量小松弛型复制

是否含有接合转移基因

非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：第七页，共36页。（一）质粒的生物学特性(tèxìng)（7）质粒的存在形式(xíngshì)有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合环（SC构型）开环双螺旋（OC构型）线状双螺旋（L构型）第八页，共36页。（二）质粒DNA的制备(zhìbèi)有多种分离质粒的方法(fāngfǎ)，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法(fāngfǎ)主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。第九页，共36页。碱变性法质粒提取的原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速(xùnsù)复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。第十页，共36页。碱变性法提取质粒的步骤：1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞(xìbāo)沉淀；2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA）涡旋震荡悬浮菌液。3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2MNaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。第十一页，共36页。（三）质粒载体(zàitǐ)的改造⑴去掉不必要的DNA区段。⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。⑶加入易于捡出的选择性标记基因。⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。⑸改造或增加(zēngjiā)基因表达的调控序列。第十二页，共36页。1、质粒pBR322

pBR3224363结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）3种限制酶单一识别位点。（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）内部有7种，启动(qǐdòng)区内有2种限制酶单一识别位点。（3）DNA复制起点（ori）第十三页，共36页。pBR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量。4363bp，2.6×106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化(zhuǎnhuà)子的选择记号。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。pBR3224363第十四页，共36页。外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端(mòduān)黏性末端(mòduān)连接酶重组子(ampstetr)空载体(zàitǐ)(amprtetr)插入子(ampstets)野生型的E.coli(ampstets)

导入涂布在含Tc的平板上重组子转化子(ampstetr)空载体转化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空载体转化子(amprtetr)因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。第十五页，共36页。第十六页，共36页。2、pUC质粒载体(zàitǐ)1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术(jìshù)在pBR322基础上构建的结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ′基因编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个(zhěnggè)载体中是唯一的。第十七页，共36页。2、pUC质粒载体(zàitǐ)与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2750bp，pUCl8为2686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过-互补(hùbǔ)作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。第十八页，共36页。-互补(alpha-complementation)大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ’基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ’基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象(xiànxiàng)被成为是alpha-complementation.X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第十九页，共36页。

释放(shìfàng)出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果LacZ’插入外源基因被破坏，菌落则是无色的。组织化学法检测(jiǎncè)重组体X-Gal-半乳糖苷酶IPTG诱导(yòudǎo)物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

半乳糖

5-溴-4-氯-靛蓝＋第二十页，共36页。二、噬菌体载体(zàitǐ)（phagevectors）（一）噬菌体载体(zàitǐ)（二）M13噬菌体载体(zàitǐ)（三）柯斯质粒载体(zàitǐ)第二十一页，共36页。1.噬菌体的生物学特性(tèxìng)溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌(xìjūn)被称为溶源性细菌(xìjūn)。在溶源性细菌(xìjūn)内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。噬菌体温和噬菌体，具有(jùyǒu)溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期第二十二页，共36页。1.噬菌体的生物学特性(tèxìng)第二十三页，共36页。2.噬菌体的生物学特性(tèxìng)第二十四页，共36页。2.噬菌体的生物学特性(tèxìng)⑴组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子(fēnzǐ)组成。DNA长度为48502bp，在分子(fēnzǐ)两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子(fēnzǐ)。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesiveendsite）.GGGCGGCGACCT第二十五页，共36页。2.噬菌体的生物学特性(tèxìng)⑵是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。⑶复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制⑷基因组成DNA至少包括61个基因，大多(dàduō)基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。第二十六页，共36页。λ噬菌体载体(zàitǐ)类型置换型（Replacementvectors）这种载体具有两个对应(duìyìng)的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon4载体克隆能力大，20～25kb插入型（Insertionvectors）这种载体仅仅(jǐnjǐn)有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：λgt10、λgt11克隆能力小，不到10kb噬菌体载体的类型第二十七页，共36页。①Insertionvectors第二十八页，共36页。②Replacementvectors

置换(zhìhuàn)型载体第二十九页，共36页。（二）M13噬菌体1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性⑴是单链闭合环状噬菌体只能(zhīnénɡ)感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。⑵复制与增殖（图）第三十页，共36页。M13噬菌体的复制(fùzhì)与增殖“＋”DNACPCP脱落(tuōluò)，“＋”DNA复制RF－DNA“θ”型复制(fùzhì)积累200～300份滚环复制＋SSB外溢时被包装M13噬菌体第三十一页，共36页。2.M13噬菌体载体(zàitǐ)的构建这类载体的突出优点在于(zàiyú)其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于(zàiyú)插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。

⑴在IS区内插入LacZ基因⑵在标记基因区内组装MCS区段所以(suǒyǐ)能通过互补在X-Gal/IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了M13mp8、9和M13mp18、19等。第三十二页，共36页。（三）柯斯质粒载体(zàitǐ)（cosmidvectors）柯斯质粒载体(zàitǐ)的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cossitecarryingplasmid的缩写(suōxiě)。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成：A.多克隆位点区B.含有cos位点的DNA区C.复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScosDNA第三十三页，共36页。（三）柯斯质粒载体(zàitǐ)（cosmidvectors）柯斯质粒载体的特性1、具有噬菌体的特性柯斯质粒连接上适宜长度(chángdù)的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性能象质粒一样在寄主细