蚕豆病实验设计课件

临床十二大班92012级本科分子生物学实验设计案例患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。案例分析3、血象红细胞1.98×1012/L（↓）﹤4.0～5.5﹥×1012/L

血红蛋白53g/L（↓）（110-150G/L）血清总胆红素85.5µmol/L（↑）1.71-17.1μmol/L4、尿常规尿液下未见红细胞（红细胞膜已不完整）尿胆素原呈阳性轻度蚕豆病并伴溶血性黄疸

根据以上信息和检查诊断蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。多见于儿童，男性患者约占90%以上。红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法）设计实验进一步明确诊断实验原理●要检测G6PD的活性，可以检测NADPH生成量实验原理●已知：NADPH在340nm的紫外线照射下产生荧光即可以每隔2分钟在340nm波长下测定孵育液中NADPH吸光度以10min吸光度值的变化（△A340）计算NADPH的产量。实验器材和试剂1.实验器材恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。2.试剂（1）0.5mol/LTris-HClMgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl2·6H2O4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。（2）2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：称取NADP＋

21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4℃可保存20天左右。（3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二钠(G6P－Na2)：称取21.5mgG6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸馏水中。4℃可保存20天左右。（4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10%EDTA2.0mL，6mmol/LNADP＋

0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。（5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6

0.2g，KCN0.052g，NaHCO3

1.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。（6）0.9%NaCl，ACD抗凝剂。实验器材和试剂

实验操作流程1、洗涤红细胞取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复三次。2、溶血液的制备向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震荡1min，4℃放置10min以上。以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（△A340）计算NADPH的产量。4.溶血液中血红蛋白含量的测定取试管一支，按下表操作：试剂体积Drabkin(mL)溶血液(mL)0.33.0混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm的吸光度（A540）。注意事项1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。结果分析1.NADPH产量的计算NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（ε）为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为：NADPH产量（μmol）=2.血红蛋白含量的计算血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔吸光细数（ε）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为：血红蛋白含量（mmol）=从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果生化角度实验室检查检查项目检查值正常值红细胞1.98×1012/L4.0—5.0×1012/L血红蛋白53g/L120—160g/L血清总胆红素85.5µmol/L3.4—17.1µmol/L结合胆红素13.7µmol/L总量的20%未结合胆红素71.8µmol/L总量的80%

结果导致红细胞膜的破坏胆色素代谢异常

谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白，从而保护红细胞膜的完整性，如若缺乏，此时的红细胞易于破裂。NADPH—高铁血红蛋白还原酶GSHMHbHb红细胞膜的破坏胆红素铁卟啉类化合物的降解产物80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解自由通过生物膜产生毒性作用具体分析

体温升高大量溶血，即血红细胞大量破坏，大量的无菌性坏死物质入血，机体动员白细胞吞噬吸收坏死物质，导致无菌性炎症，可引起发热，亦称为吸收热。

呼吸加快及心律升高

由于急性溶血导致循环血量减少，红细胞减少，血红蛋白减少，氧气供应相对不足，故机体通过加快呼吸频率，以及加快心率维持心输出量的相对稳定以维持机体代谢的供氧。患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）患者体型瘦小与该病症有关

蚕豆病是因为体内缺乏G6PD，

G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径该途径主要生成两种重要的物质即5-磷酸核糖和NADPH5-磷酸核糖影响：1：核酸的合成2：体内己糖和戊糖的代谢3：3—7碳原子糖类物质的相互转化G6PDNADPH影响：1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇脂肪酸和一些非必需氨基酸2：

NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用3：

NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用4：维持GSH的正常水平GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化使蛋白质或酶处于活性状态磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以合成甘油三酯则消耗原有储备的甘油三酯，使得机体消瘦。同时体内的一些生物活性物质功能发生障碍，如胆固醇不能直接氧化但能转化为胆汁酸、类固醇激素、维生素D3，参与物质代谢调节，胆汁酸具有促进脂类消化和吸收的作用；维生素D3主要参与体内血钙和血磷的调节。生物转化作用可以对体内大部分非营养物质进行代谢转化，或使有毒物质的毒性减低或消除，增强这些非营养物质的水溶性和极性，从而易于从胆汁或尿液中排除。GSH