本科生设计性实验生化-蚕豆病课件

2012年设计性实验2012级临床五大班实验室二星期三上午组别：一组资料收集：杨汝平(201201235)(201201236)邱翼(201201238)(201201234)(201201239)(201201240)汇报：向德航(201201237)案例

患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。（尿三胆）尿胆素（+）、尿胆红素(－)、尿胆素原(+)肝肠循环增多胆红素单核吞噬系统降解血红素红细胞破裂血红蛋白渗出尿蛋白(++)(1.0g/l)运氧功能障碍溶血性贫血循环血量减少血压下降脉搏加快(心率加快)呼吸加快过多>34.2umol/L时，黄疸①血清总胆红素↑②结合胆红素变化不大（水溶性大，随尿排出）③未结合胆红素↑（水溶性小，不能随尿排出，有毒）酱油尿初步判断是何种病？诱因：一天前食用蚕豆既往史：姐姐也曾出现过此症状蚕豆病（6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症）蚕豆病发病机制食用蚕豆产生大量过氧化氢，不被清除红细胞膜脂质被氧化破坏急性血管内溶血，产生过多胆红素导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。NADPH+H+缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素。胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化氢，氧化应激可诱导HO-1的表达，从而增加胆红素的量升高来抵御氧化应激状态。从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果主要临床表现：1.血尿、排酱油色尿、面色苍白

2.皮肤及巩膜黄染

3.体温升高

4.呼吸急促1.血尿、排酱油色尿、面色苍白G6PD↓GSH的主要作用：①保护红细胞内的含硫氢基（-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化②与谷胱甘肽过氧化酶共同使

H2O2还原成H2O→NADPH+H+↓→红细胞的抗氧化能力↓→GSH↓→红细胞膜破裂→溶血性贫血（面色苍白）→游离Hb>肾吸收阈值→血红蛋白尿/含铁血黄素尿2.皮肤及巩膜黄染4.呼吸急促溶血性贫血↓具有载O2能力的Hb含量下降↓机体缺O2↓呼吸急促实验设计高铁血红蛋白还原法实验思路患者姐姐出现过此类状况推测属于家族性遗传，且患者在食用蚕豆后出现症状，故即有可能为蚕豆病。6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁血红蛋白的还原，故可以依据如下反应机制设计实验。亚铁血红蛋白高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原酶

NADPH(辅酶)

亚甲蓝(递氢体)亚硝酸钠实验反应方向二、实验原理

在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）。三、实验器材及试剂器材：离心机、分光光度计、微量移液器水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管试剂：①0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液；②0.4mmol/L亚甲蓝溶液；③0.28mol/L葡萄糖溶液、混合液（等量①+②+③）生理盐水、抗凝剂、患者静脉血、蒸馏水四、实验步骤1、取静脉血1.8mL于抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg），混匀2、离心沉淀1000r/min15min3、调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀，（调整后全血）4.1ml0.18mol/L亚硝酸钠、1ml0.28mol/L葡萄糖溶液、0.14mmol/L亚甲基蓝液，混匀，得到混合试剂1ml五、实验结果实验结果计算：计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%计算出其还原率与正常值比较六、实验分析该患者可能患有先天性镰刀贫血症或蚕豆病。正常的高铁血红蛋白还原率>75%，若计算所得还原率低于75%，且患者姐姐也有类似症状，患者吃过蚕豆后发病，故可推断患者患有蚕豆病七、注意事项1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较