液质联用技术的原理与应用-(2)教学提纲

液质联用技术的原理与应用-(2)解题为何要联用？

以LC-MS为例：LC的色谱分离＋MS的质谱分

离（m/z分离）两个维度依次分离，是乘法，非加法！结合了LC和MS二者的优点辨证地看待“联用”仪器的小型化、微型化，如waters公司的Qda检测器；ICP-MS。Waters公司的液质联用仪QqQQTOFSciex公司的质谱仪QTRAPQTOFQqQOrbitrapThermoFisher公司的液质联用仪Agilent公司的质谱联用仪ICP-QqQ质谱仪GC-QqQ质谱仪用途和优点以LC-QqQ-MS定性、定量最常用的多反应监测（MultipleReactionMonitoring，MRM）模式为例灵敏度高

准确地说——信噪比高LC：μg/mL（ppm）LC-MS：ng/mL（ppb）、pg/mL（ppt）特异性好

干扰小，定性准确

降低了对样品前处理的要求

是公认的确证分析技术！低分辨率质谱仪用途和优点以QTOF和Q-Orbitrap为代表：质量准确度高（m/z精确到小数点后3-5位）定性筛查的利器：半未知、全未知化合物如：北京CDC高分辨率质谱仪从历史谈起离子源和质量分析器有多种不同的类型以两大主线介绍质谱仪的发展史进样系统离子源（使分析物电离）离子光学系统质量分析器（实现m/z分离，质谱仪通常据其命名）检测器真空系统计算机系统质谱发展史上的两位先驱1897年，J.J.Thomson（汤姆孙，1856～1940）质谱仪的雏形1919年，F.W.Aston（阿斯顿，1877～1945）首次制成具有较高聚焦性能的质谱仪，用其成功发现了多种同位素，获1922年的诺贝尔化学奖质量分析器发展史1917年，Dempster

发明扇形磁场质谱仪（扇形磁场分析器）1934年，Mattauch和Herzog1953年，Johnson和Nier

分别设计出了两种双聚焦质谱仪（扇形磁场分析器＋

扇形电场分析器）1946年，Stephens

发明飞行时间（Time-of-Flight，TOF）质谱仪1949年，Hipple

发明离子回旋共振（IonCyclotronResonance，ICR）

质谱仪，是首个超高分辨率质谱仪质量分析器发展史1953年，W.Paul（保罗，1913～1993）提出四极质量分析器（QuadrupoleMassAnalyzer，QMA）和四极离子阱（QuadrupoleIonTrap，QIT）的理论，随后出现了四极质谱仪和QIT质谱仪H.G.Dehmelt（德梅尔特，1922～）对ICR质谱仪的发展作出突出贡献与

Paul共享了1989年诺贝尔物理奖的一半质量分析器发展史1977年和1984年两种重要的串联质谱仪——三重四极（TripleQuadrupole，QqQ）质谱仪和QTOF质谱仪诞生1995年和1998年，Bier等和Hager

分别设计出了两种线性离子阱（LinearIonTrap，LIT）1999年，A.Makarov（1966～）全新概念的分析器——轨道阱（Orbitrap）离子源发展史气体放电电离、火花电离、辉光放电电离、热电离最出现的电离技术，属于无机电离技术1918年，A.J.Dempster

发明电子电离（ElectronIonization，EI）

最早的有机电离技术，至今仍广泛使用1954年，Inghram和Gomer

场电离，最早的“软”电离技术1966年，Munson和Field

发明化学电离（ChemicalIonization，CI）离子源发展史1969年，Beckey场解吸，打开了MS用于生物大分子分析的大门1980s，Fenn（芬恩，1917～2010）

使电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）取得重

大突破1973年，Horning大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）1980年，Houk以电感耦合等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）为离子源，发明了ICP-MS，是元素分析的利器离子源发展史1987年，Tanaka（田中耕一，1959～）将基质辅助激光解吸电离（Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization，MALDI）用于蛋白质分析；因将ESI和MALDI引入生物大分子领域的卓越贡献，Tanaka与ESI的发明者Fenn分享了2002年诺贝尔化学奖的一半MS基本原理MS是与光谱法、核磁共振波谱法并称的三大物质定性手段之一MS是通过形成气相离子来研究物质的一种方法，根据质量、电荷、结构和（或）理化性质的差异，运用质谱仪对离子进行表征提前是化合物能形成离子m/z分离通过质量分析器实现（电场；磁场；电场＋磁场）关于m/z的理解什么是“质”？什么是“荷”？用于描述微观离子质量的单位千克（Kg，SI单位，但单位太大）道尔顿（Dalton，Da）

JohnDalton（1766～1844）统一原子质量单位（UnifiedAtomicMassUnit，u）1u＝1Da＝1.660538921（73）×10－27kg

注：原子质量单位（AtomicMassUnit，amu，已废弃）关于m/z的理解相对质量VS绝对质量初中化学的重要概念“相对原子质量（原子量）”相对质量单位为“1”，绝对质量单位为u、Da等相对质量与以u为单位的绝对质量在数值上相等实际质量VS平均质量要区分“元素”和“原子”的质量。例如，原子质量是实际质量，元素质量是平均质量（考虑了同位素丰度）。原子量（是元素的质量）≠原子质量分子量（是元素质量的加和，MS中不能直接运用）同位素分布Sn的同位素分布同位素分布瘦肉精（C12H18Cl2N2O）的同位素分布同位素标记内标：选择占比较少的同位素组成形式质谱图质谱图（MassSpectrum）以离子的m/z为横坐标，质量峰的强度为纵坐标注意：质谱图并非指MS所得图谱的总称横坐标既非保留时间，也非离子质量a、轮廓图b、棒图提取离子色谱图质谱仪直接采集得到的是质谱图，经计算机加工得到色谱图质谱图是色谱图的基本组成单元分辨率分辨率（Resolution，R）反映的是相邻质谱峰的分离程度目前最常用的定义是“半峰

全宽（FullWidthatHalf

Maximum，FWHM）定义”

分辨率低分辨率：R＜1000中分辨率：R＝1000～10000高分辨率：R＝10000～100000超高分辨率：R＞100000QMA是低分辨率，TOF和Orbitrap是（超）高分辨率通常，QMA的质谱峰的半峰宽为0.7

质量准确度准确质量（AccurateMass）：实测值精确质量（ExactMass）：理论值质量准确度：二者的误差分辨率会影响质量准确度QMA的质量准确度一般为0.1u质谱仪简介SCIEX的QqQ和QTRAPTMThermoFisher的OrbitrapSCIEX、Waters、Bruker的QTOFBruker的FT-ICR价格GC-MSQ：～80万QqQ：～120万LC-MSQqQ：220～330万QTOF：300～400万Q-Orbitrap：400～600万ICP-MSQ：100～150万QqQ：200～250万质谱仪硬件组成进样系统直接进样（如注射泵）、色谱仪等离子源离子光学系统冷却、聚焦、准直等质量分析器检测器电子倍增器、微通道板等真空系统为何需要保持真空？为何通常需要待机？需要液氮，是否矛盾？计算机系统离子源离子源是使样品分子、原子或自由基转变为气相离子的器件，是质谱仪的“门户”有机MS中几种常见的离子源电子电离（ElectronIonization，EI）源化学电离（CI）源较“软”电离；需要试剂气；适合GC大气压电离（AtmosphericPressureIonization，API）源基质辅助激光解吸电离（MALDI）源适合蛋白质分析无机MS中几种常见的离子源

感耦等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）源EI源曾称为“电子轰击（ElectronImpact，EI）”电离源特点“硬”电离分子离子、碎片离子；

多用于一级MS质谱图重复性好API源顾名思义，API是在大气压而非高（如EI）或低（如CI）真空环境中实现的一类电离技术API源的出现，解决了色谱仪与质谱仪接口的难题，极大地推动了LC-MS的成熟API源主要包括以下3种类型电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）源大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）源大气压光电离（AtmosphericPressurePhotoionization，APPI）源ESI源SCIEX公司的ESI源ESI源Waters公司的ESI源（Z-Spray）ESI源Agilent公司的ESI源ESI的机理电离过程大致可分成三个阶段（以ESI＋为例）：第一阶段：使溶液分散成带电雾滴强电场→液滴形成泰勒锥→瑞利稳定极限→锥喷流（Cone-Jet）→约1mm后就迅速膨胀为羽流（Plume），即多个带正电荷的直径为1～2μm的雾滴（高压静电＋气动辅助）ESI的机理锥喷流的照片ESI的机理第二阶段是溶剂蒸发与雾滴-喷流分裂（Droplet-JetFission）溶剂蒸发→雾滴缩小→电荷密度增加→当达到瑞利稳定极限时→遂发生“雾滴-喷流分裂”→循环往复→体积越来越小ESI的机理第三阶段是产生气相离子，即离子从溶液中转移出来以气态存在离子蒸发模型（IonEvaporationModel，IEM）当雾滴半径达nm级时，高挥发性的离子聚集在雾滴表面，在强电场作用下发生场辅助蒸发，直接从雾滴中“弹出”，成为气相离子。带电残渣模型（ChargedResidueModel，CRM）该模型认为只有雾滴中的溶剂完全蒸发时，化合物才能继承多电荷形成一个气相离子。两种模型均有实验支持。一般认为，小分子化合物可用IEM解释，大分子化合物则用CRM解释ESI的特点在大气压下进行对比：EI在真空状态下进行“软”电离形成离子：加合离子[M＋H]＋、[M＋Na]＋、[M＋NH4]＋、[M＋Cl]－等；去质子化分子[M―H]－

对比：EI是“硬”电离单电荷与多电离离子小分子以单电荷离子为主，大分子以多电荷离子为主基质效应可能存在基质增强或抑制如何判断是否存在？解决办法？（同位素标记内标、基质加标、改进样品前处理……）质量分析器1.四极质量分析器（QMA）定性、定量的利器；灵敏、特异，线性范围宽2.四极离子阱（QIT）捕获离子；可实现多级质谱法；定性能力强，定量能力不及QMA3.线性离子阱（LIT）离子容量比QIT大，许多性能优于QIT；有2种类型，其中一种为QTRAPTM（Q-LIT）注：以上3种质量分析器有共同的理论基础——Mathieu（马蒂厄）方程质量分析器4.飞行时间（TOF）质量分析器高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查5.轨道阱（Orbitrap）超高分辨率（高质量准确度）；（半）未知物筛查6.扇形磁场分析器7.扇形电场分析器不能单独组成质谱仪；与扇形磁场分析器组成双聚焦分析器（最早出现的分析器之一，辉煌的时代已成过去时……）8.离子回旋共振离子阱（ICR-IT）超高分辨率（高质量准确度）；价格十分昂贵四极质量分析器U是直流（DC）电压V是射频（RF）电压理论基础——Mathieu方程由法国数学家É.Mathieu（马蒂厄，1835～1890）于1868年提出，最初是为了解决椭圆形鼓膜的横向振动一类的问题，后来发现可用来描述离子在四极场中的运动轨迹及稳定运动的条件运动方程Orbitrap（轨道阱）TOF串联质谱仪和多级质谱仪由两个及以上的质量分析器串联组成碰撞池是连接各质量分析器的桥梁单一型QqQ、QqQqQ、TOF-TOF杂交型Q-LIT、QTOF、Q-Orbitrap、LIT-Orbitrap、QIT-TOFQqQ和Q-LIT质谱仪QqQ（QoQ、QhQ）h表示六极杆（Hexapole）、o表示八极杆（Octopole）碰撞池仅加RF电压；小写q以示区别碰撞气（以N2居多）QqQ和Q-LIT质谱仪QTRAP系列串联质谱法和多级质谱法串联质谱法（MS/MS，MS2）和多级质谱法（MSn）先驱离子（母离子、前体离子）和产物离子（子离子、孙离子、第n代产物离子）是相对而言的m1＋→m2＋→m3＋→m4＋→m5＋空间MS/MS和MSn在串联质谱仪和多级质谱仪上实现时间MS/MS和MSn通过不断增加分析器个数来增加MS的级数毕竟是不现实的不需要串联质谱仪和多级质谱仪QIT、LIT和ICR等离子阱类质谱仪单级MS扫描模式以四极质谱仪为例：Q1全扫描（Q1FullScan）Q1选择一段m/z范围的离子通过，q2、Q3全通过用于需找未知化合物；目标化合物的方法开发Q3全扫描（Q3FullScan）Q1、q2全通过，Q3选择一段m/z范围的离子通过单级MS扫描模式选择离子监测（SelectedIonMonitoring，SIM）Q1选择一个特定m/z的离子通过，q2、Q3全通过或者，Q1、q2全通过，Q3选择一个特定m/z的离子通过目标化合物的定性、定量分析信噪比比全扫描更高GC-MS最常用的扫描模式MS/MS扫描模式多反应监测（MultipleReactionMonitoring，MRM）又称为“选择反应监测（SelectedReactionMonitoring，SRM）”“反应”指的是碰撞反应MRM是QqQ最主要的工作模式，用于定量分析MS/MS扫描模式MRM模式下，每一化合物选择2组离子对即可确证CommissionDecisionof12August2002:ImplementingCouncilDirective96/23/ECConcerningthePerformanceofAnalyticalMethodsandtheInterpretationofResults(2002/657/EC).OffJEurCommunities，2002，L221：8.MS/MS扫描模式产物离子扫描（ProductIonScan）与MRM不同的是，Q3是选择一段m/z范围的离子通过进一步增加定性的可靠性食品安全风险监测食源性疾病、食品污染以及食品中有害因素（物理、化学、生物因素）食品安全风险监测食品安全风险监测食品安全风险监测真菌毒素（DONs和ZON）真菌毒素（DONs和ZON）化合物母离子（m/z）子离子（m/z）所用内标DON295.1264.9*13C15-DON138.13-ADON337.1307.1*13C15-DON173.115-ADON337.1150.1*13C15-DON219.0ZON317.2175.013C18-ZON273.213C15-DON310.1279.0*—144.913C18-ZON335.3185.2*—290.2*定量离子。真菌毒素（DONs和ZON）硝基呋喃代谢物硝基呋喃代谢物样品匀浆→加入10mL甲醇-水（1:1）振荡提取→弃去液体→加10mL0.2mol/L盐酸→均质→加入混合内标标准溶液、邻硝基苯甲醛溶液→置37℃恒温箱中过夜→加1mL0.3mol/L磷酸钾→氢氧化钠调pH7.4