微生物遗传与育种精美课件

微生物遗传与育种第七章第一节

微生物遗传的物质基础

一、遗传物质化学本质的确证1、DNA（或RNA）是遗传信息的携带者三个经典实验

细菌转化实验噬菌体感染实验病毒重建实验动物实验细菌培养实验

热死S菌―――→不生长

活R菌―――→长出R菌

热死S菌+活R菌――→长出大量R菌和10-6S菌S型菌的无细胞抽提液试验

活R菌+S菌无细胞抽提液――→长出大量R菌和少量S菌培养皿培养培养皿培养培养皿培养培养皿培养1944年Avery等对热死S型菌中可能的转化因子在离体条件下进行了转化试验：活R菌长出S菌只有R菌加S菌DNA

加S菌的RNA加S菌的荚膜多糖加S菌的蛋白质加S菌的DNA和DNA酶加S菌DNA及DNA酶以外的酶病毒重建实验H.Fraenkel-Conrat，1956实验材料烟草花叶病毒（TMV）霍氏车前花叶病毒（HRV）处理在一定浓度的苯酚溶液中振荡，分离蛋白质外壳与RNA核心3、DNA的复制半保留复制复制起点、复制方向、复制单位DNA的半不连续复制3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)3-OH5-P55533335'滚环复制5'53354、生物染色体、病毒遗传物质原核生物的染色体核区，无核膜包裹，DNA裸露，不与蛋白形成复合体染色体组成：DNA、RNA、蛋白质往往只有一条染色体，大多数以双链、共价闭合的环状形式存在真核生物的染色体核膜包裹，线性DNA与组蛋白结合形成染色体染色体不止一个，每个染色体中含有1个线性DNA分子细胞分裂中期呈棍棒状，静止期为颗粒状染色体基本组成单位：核小体两种生物染色体DNA复制区别复制子大小、数量上差异复制起点、复制速度、方向上差异一、基因概念和微生物的基因结构概念一段具有特定功能和结构的连续的DNA片断，是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。原核生物基因的结构真核生物基因的结构一般无操纵子结构存在大量不编码序列和重复序列转录和转译在细胞中有空间间隔基因被许多无编码功能的内含子阻隔，使编码序列变成了不连续的外显子。二、基因组基因组（genome）单倍体细胞中所含的全套遗传物质大多数细菌和噬菌体基因组是指单个染色体上所含的全部基因二倍体真核生物基因组是指单倍体细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因第三节

质粒和转座子

PlasmidandTransposon一、质粒概述质粒（plasmid）存在于各种微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自主复制的遗传因子。特点可自我复制、稳定遗传；非必需；可转移；可整合；可重组；可消除质粒的大小和复制三、质粒的主要类型据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分类致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞离子（mer）磺胺(sul)链霉素(str)梭链孢酸（fus）氯霉素(cam)四环素(tet)R100质粒的遗传图谱四、转座子的类型和分子结构转座因子（transposableelement）的概念可在DNA链上改变自身位置的一段DNA序列。转座因子的共同特征插入寄主DNA后，导致基因失活；转座以后，原来的转座子依然保持在原位，而在靶序列上复制了一个转座子；插入时在靶DNA位点产生一个短的正向重复序列。根据转座机理不同分类转座子反转座子原核生物中的转座因子类型插入（IS）序列转座子(Tn)某些温和噬菌体插入序列（insertionsequence,IS）特点在IS两端含有长为10-40bp反向重复序列（IR）。大多IS都含有一个引起转座的转座酶基因。在IS插入时，在靶DNA位点产生一个长度3-9bp正向重复序列，分布在IS两侧。分布在细菌染色体、质粒、某些噬菌体DNA上转座子(Tn)除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因（对抗生素、某些毒物）、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。IS与Tn有两个共同特征都携带有编码转座酶的基因，该酶为转座所必需；两端都有反向末端重复序列，只是长度不同。IS与Tn主要区别Tn携带有与转座无关的抗性基因或其它特性基因细菌抗药性转座子的两种类型复合转座子由两个完全相同或类似的插入序列IS和某种抗药性基因组成的复合因子。复杂转座子两端具有IR或DR，而不是IS，中部的编码区不仅编码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。两个IR中任一个缺乏都会阻遏转座特殊病毒（Mu噬菌体）与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的基因次序是相同的。没有固定的整合位置转座子的遗传效应遗传效应插入突变DNA重排极性效应第四节

基因突变与遗传育种

一、基因突变突变的概念变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传性变化。突变率常在10-8~10-9范围内。按突变涉及的范围分基因突变染色体畸变基因突变的类型从突变的效应来分

原序列5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly(1)同义突变5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly(2)错义突变5‘-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly(3)无义突变5‘-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg按突变所带来的表型改变分形态突变型

因突变而产生的个体形态或菌落形态的变异生化突变型营养缺陷型抗性突变型致死突变型条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型突变的机制突变自发突变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位诱变移码突变（缺失添加）点突变碱基置换（转换颠换）二、突变与育种自发突变与自然选育1、自发突变的特点自发性

突变的结果与原因之间的不对应性稀有性

10-9～10-6诱变性独立性：一个基因的突变对其它基因突变物影响，同时发生2个突变的几率很低。稳定性可逆性2、自然选育目的纯化与复壮菌种，保持稳定的生产性能步骤通过表现形态来淘汰不良菌株——初筛通过目的代谢产物产量考察——复筛进行遗传基因型纯度试验传代稳定性试验诱发突变与诱变育种概念诱发突变指人为地运用物理、化学或生物的方法处理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型的目的。诱变育种指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状突变株的过程。常用的诱变剂物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂诱变处理的基本方法诱变剂的选择了解诱变剂的性质、作用机理、使用方法充分利用复合处理的协同效应一次复合因子处理后需经多次分离纯化。剂量的选择一般诱变效应随剂量增高而增高，达到一定剂量后，再增大剂量诱变率反而下降。诱变剂量确定与出发菌株特性、诱变剂性质、实际效果有关。增效剂影响诱变效果的因素出发菌株出发菌株的生理状态细菌——对数生长期真菌、放线菌——幼年孢子外部环境诱变方法物理诱变化学诱变合适的诱变因素剂量微生物的诱变育种的步骤和方法优良突变菌种的筛选初筛以量为主，复筛以质为主直接摇瓶筛选法数据直观可靠，与生产接近，但工作量大一般都应进行单菌分离注意及时保藏营养缺陷型菌株筛选与筛选营养缺陷型突变株有关的培养基基本培养基（MM，minimalmedium）“[－]”仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基。完全培养基（CM，completemedium）“[＋]”满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基。补充培养基（SM，supplementalmedium）只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。补充培养基的符号可根据加入的是A或B等代谢物而分别用[A]或[B]等来表示。营养缺陷型菌株筛选方法获得野生型菌株→诱变剂处理→淘汰野生型→检出营养缺陷型→鉴定缺陷型中间培养：完全培养基或补充培养基淘汰野生型菌株抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法、饥饿法营养缺陷型检出夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印接种法夹层培养法影印接种法确定生长谱三、基因重组和微生物育种基因重组（generecombination）两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传基因组的过程。核酸分子水平上的杂交重组可使生物体在未发生突变的情况下，产生新遗传型的个体。基因重组的方式原核微生物的基因重组转化、转导、接合、原生质体融合真核微生物的基因重组有性杂交、准性杂交、原生质体融合原核微生物的基因重组转化（transformation）受体菌直接接受来自供体菌的DNA片段，通过交换组合将其整合到自己基因组中，从而获得供体菌某些遗传性状的现象。转化后的受体菌称为转化子（transformant）供体菌的DNA片段称为转化因子（transformingprinciple）。发生转化的条件

菌株之间的亲缘关系（受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合）受体细胞必须处于感受态（competence）受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。感受态细菌吸收DNA的能力比一般细菌大1000倍不论是否处于感受态，细菌都能吸附DNA，但只有处于感受态的细菌，吸附的DNA才被吸收不被降解（受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解）转化过程转导(transduction)通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）转导的类型普遍转导、局限转导、溶源性转变普遍性转导（generalizedtransduction）通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段的误包，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象一般以温和噬菌体作为媒介完全普遍转导流产普遍性转导经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不消失，而仅进行转录、转译和性状表达的现象。局限转导（specializdtransduction）通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）特定基因由部分缺陷型噬菌体携带低频“误切”或双重溶源菌的裂解而形成。局限性转导普遍性转导与局限性转导的区别区别要点普遍性转导局限性转导基因转导发生的时期裂解期溶源期转导的遗传物质供体菌染色体DNA任何部位或质粒噬菌体DNA及供体菌DNA的特定部位转导的后果完全转导或流产转导受体菌获得供体菌DNA特定部位的遗传特性转导频率受体菌的10-7转导频率较普遍转导增加1000倍(10-4)溶源性转换（lysogenicconversion）当噬菌体感染细菌时，宿主菌染色体中获得了噬菌体的DNA片段，使其成为溶源状态时而致细菌获得新的性状。原生质体融合（protopastfusion)将两种不同的细菌经溶菌酶或青霉素等处理，失去细胞壁成为原生质体后进行彼此融合，进而发生遗传重组，以产生同时带有双亲性状、遗传性稳定融合子的过程。标记菌株的筛选→原生质体的制备→原生质体的融合→原生质体的再生→融合子的选择→优良菌种的筛选接合（conjugation）供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得新性状的受体细胞称为接合子。接合性质粒能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。四种相互联系的接合型菌株：F+菌株、F-菌株、F´菌株、Hfr菌株F+×F-F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF´×F-F´F´F´F´F´F-F´F-HfrF+F+HfrHfr×F-HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-真核微生物的基因重组有性杂交一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。准性杂交同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。有性生殖与准性生殖的比较项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理有分化的性细胞独立生活的异核体阶段有无接合后双倍体的细胞形态与单倍体基本相同与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径通过有丝分裂通过减数分裂接合发生的几率偶尔发现，几率低正常出现，几率高第五节

微生物基因工程基因工程概念基因水平上的遗传工程将某一生物体的遗传信息在细胞外与载体相连接，构建成一个新的重组DNA分子，然后将其转入另一些生物体细胞中，使引入的供体DNA片段成为受体遗传物质的一部分，其所带的遗传信息得以表达或创建出一个新物种。特点体外重组、远缘杂交、定向性基因工程的主要步骤从供体细胞的DNA中分离限制性内切酶酶切特异性DNA片段的PCR扩增以DNA一条链为模板，在多聚酶催化下，通过碱基配对使寡核苷酸引物向3´方向延长合成模板的互补链。整个过程分三步：变性、退火、延伸PCR引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其3´端必须具有游离的－OH基团。目的基因分离的途径构建cDNA文库和基因组文库分离目的基因cDNA文库（cDNAlibrary）某生物所转录的全部mRNA

经反转录形成的cDNA片段，再复制成双链cDNA，与合适的克隆载体连接，通过转导（转化）转入受体菌，这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群体称为。基因文库（genomicDNAlibrary）存在于转化细菌中、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。涵盖基因组的全部基因信息主要用于真核微生物、动植物中特定基因的克隆由化学方法合成特定功能的基因DNA合成仪，根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，可自动地将4种核苷酸单体按3´→5´磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。主要用于结构简单、核苷酸顺序清楚的基因克隆目前常用此方法合成引物、寡核苷酸连杆以及基因片段等。目的基因导入受体细胞受体细胞原核生物细胞如大肠杆菌、蓝藻等酵母菌、动植物细胞载体载体种类质粒载体噬菌体载体根据特殊要求构建的载体载体必须具备的几个条件必须是一个复制子，不宜过大；在受体细胞中有较高的复制率，能稳定遗传；最好只有一个限制性内切酶切口，使目的基因能固定的整合到载体DNA的一定位置上；载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来目的基因组入克隆载体克隆载体的选择目的基因与载体DNA体外重组限制性内切酶处理或人为地连接粘性末端低温（5~6℃）混合“退火”由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸组分，所以二者相混，凡粘性末端上碱基互补的片段通过氢键形成双链连接酶使目的基因与载体DNA连接形成重组载体重组DNA分子导入原核生物细胞转化、转导、三亲本杂交转化克隆子的筛选利用抗菌素抗性基因进行筛选利用乳糖操纵子lacZ´基因筛选利用双酶切片断重组法初筛利用报告基因筛选克隆子克隆子的鉴定限制性酶切法、分子杂交法、DNA测序法、目的基因转录产物检测、目的基因翻译产物检测第六节

微生物菌种保藏及复壮一、微生物菌种保藏微生物菌种保藏目的妥善保藏使菌不死、不衰、不乱，便于交换使用和研究。原则是尽量降低菌种的代谢活动，隔绝外界影响。原理选典型优良纯种，最好用休眠体，如分生孢子、芽孢等。创造一适合其长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，使微生物生长受抑制，代谢不活泼。选择菌种保藏方法要考虑的因素保持原菌优良性状不变；方法通用，操作简便，设备普及。注意：传代菌种每一株菌最好保持培养两个以上；温度：比正常偏低；接种间隔时间：与培养