蛋白质含量的测定

实验四、蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250法，紫外吸收法一、基本原理

利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、红外光和激光200~800nm光谱区的辐射来进行定性定量分析和物质结构分析测定的方法。称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。可见光区为400nm-800nm。

测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。

Beer-Lambert定律朗伯-比尔光吸收定律：

A＝－lgT＝εbc

A：吸光度，又称光密度“O.D”。T：透光度，T＝I/I。（I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强）ε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol－1·cm－1）。b：样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm。c：样品浓度（mol/L）。

由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。摩尔吸光系数：，是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常ε＝10-105：一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103-104

为较强吸收；ε＜102

为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001,所以，当b＝1cm,ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8mol/L。吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数=8.2×103

M－1cm－1（M＝mol/L）。∵A＝εbC∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10－5mol/L3.影响吸光系数的因素ε的大小取决于物质的本性和光的波长化学因素：溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶剂间的作用等等原因而发生偏离Beer定律的现象。化学因素引起的偏离，有时可控制溶液浓度设法减免。比如在强酸性溶液中滴定铬酸溶液就可以避免偏离现象。光学因素：非单色光、杂散光、散射光、反射光以及非平行光等都会造成偏离现象。考马斯亮蓝G250法原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg/mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定试剂:标准蛋白质溶液（0.5mg/ml）考马斯亮蓝G250蛋白染色剂操作步骤标准曲线的绘制：取8只试管，分别加入0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL标准蛋白质溶液，用水补足体积至3mL,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。样品测定：样品液1mL,用水补足体积至3mL,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，

595nm测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。计算样品中蛋白质的含量紫外吸收法测定核酸蛋白质的含量原理：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在280nm处有吸收峰。其吸收值与含量成正比关系。可用作定量测定。紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。蛋白质浓度（mg/mL)=1.45A280-0.74A260；DNA浓度（μg/mL)＝A260×稀释倍数／（0.024×L）试剂：标准蛋白质溶液（1mg/ml)操作步骤取两只小试管，甲管加入1.5mL

样品（蛋白质或核酸）1.5mL蒸馏水，乙管加入3mL蒸馏水，(注意：此实验与书上步骤不同，直接测试按公式计算即可)

测定样品在28