第十章吸光光度法

第十章吸光光度法

特点灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%

准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛

吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。第一节物质对光的选择性吸收一、光的基本性质光的波粒二象性波动性粒子性E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,

焦耳）：光子的频率（Hz,赫兹）

：光子的波长（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常数（6.625610-34J.s

焦耳.秒）结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。光的电磁波性质射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿二、物质对光的选择性吸收（一）物质对光产生选择性吸收的原因吸收光谱光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关。物质对光的吸收物质对光的吸收满足Plank条件hS2S1S0S3E2E0E1E3hhh物质对光的选择吸收

物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。例：A物质B物质同理，得：1ev=1.610-19J.（二）物质的颜色与光吸收的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光（三）吸收曲线（吸收光谱）将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测量每一波长下，有色溶液对光吸收的强度(A)，作A--λ曲线图

吸收光谱反应了不同物质的不同特征吸收：同一物质对不同波长的光的吸收强度不同，如

KMnO4对400nm吸收少，对525nm吸收最大，称

λmax

。(2)同一物质浓度一定时，在某波长下吸收强度一定，浓度不同吸收强度不同，c愈大，A愈大，是光谱定量的依据。

(3)同一物质分子运动的形式相同，结构相同，吸收曲线的形状相同，且λmax位置不变

。(4)不同物质的吸收曲线形状不同，决定了物质的结构分析的依据。

(5)若选择在λmax处测量A，则灵敏度高。

(6)从吸收光谱曲线得出结论：c愈大，颜色愈深，吸收光愈强；c愈小，则相反。

定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比AC增大第二节光吸收的基本定律一、朗伯-比尔定律透光率（透射比）透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%吸光度A

(Absorbance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT

朗伯定律(1760)：

A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的，吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。比尔定律(1852)：

A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的，液层厚度b

一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc吸光度A、透射比T与浓度c

的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20（一）朗伯-比尔定律的推导I0dbbItII-dIdI

∝NIN：薄层中的吸光粒子数N=N0cdSdbN0：阿伏加德罗常数dS

：捕获面积，薄层中光照射的面积c：吸光溶液的浓度N=k’

cdb故

dI

∝NI=Ik’

cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb积分得或得朗伯-比尔定律的适用条件1.

单色光

应选用max处或肩峰处测定3.吸光质点之间无相互作用

稀溶液，浓度增大，分子之间作用增强。

2.吸光物质为均匀非散射体系

4.辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程

无荧光和光化学现象发生（二）吸收系数和桑德尔灵敏度1、吸收系数a和摩尔吸收系数(

)

A=K·b·c

(1)

当

c=g/L、b=cm：

K=a=L·g-1·cm-1

A＝abc(2)

当

c=mol/L、b=cm：

K==L·mol-1·cm-1

A＝

bc

影响值大小的因素

(1)入射光波长

(2)与被测物质有关(FeSCN

，k=200；

Fephen1.1×104

)

(3)温度，酸度，介质，有色物结构

(4)不随

c或A值变化

越大,灵敏度越高:

<104为低灵敏度

104～105为中等灵敏度

>105为高灵敏度2、桑德尔灵敏度定义：当光度检测器的检测极限为A=0.001则：单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质最低含量。用S表示，单位：g·cm-2A=bc

=0.001

bc

＝0.001/

S小灵敏度高;

相同的物质，M小则灵敏度高。变换单位:bcmcmol/L=bcM106g/1000cm2例

邻二氮菲光度法测铁，cFe=1.0mg/L,

b=2cm，A=0.38，计算、S解：

cFe

=1.0mg/L=1.0×10-3/55.85=1.8×10-5(mol·L-1)S=M/=55.85/1.1×104=0.0051(g/cm2)例

比较用以下两种方法测Fe的灵敏度B、用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁ε533＝2.2×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(2.2×104)＝0.0025(g·cm-2)B方法比A方法的灵敏度高A、用邻二氮菲光度法测定铁时，ε508＝1.1×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(1.1×104)＝0.0051(g·cm-2)[例]已知含Fe2+12.5μg/25mL，用邻二氮菲显色后形成Fe(Phen)3，用2cm比色皿在λ508nm测得A=0.19，求ε=？

[解]

μg·10-6

———

12.5·10-6(g)Fe(g/mol)25

[Fe2+]=cFe=—————/

————=———

25mL1000M

——

1000=8.95×10-6mol/L

A0.19ε=——=

=1.1×104L·mol-1·cm-1

bc2×8.95×10-6(三）标准曲线的绘制及其应用绘制A-c（吸光度-浓度）曲线，得到一条通过原点的直线，即标准曲线。溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(标准曲线)

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx二、引起偏离朗伯

–比尔定律的因素

主要原因物理因素化学因素（一）物理因素1.非单色光引起的偏离

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光

照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度设入射光由1和2两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律1

2

1+2

入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状结论：选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）选λmax作为测定波长（Δ↓，S↑且成线性）成线性关系A与C不成线性关系，偏离比尔定律Ａ与Ｃ偏离线性关系越严重讨论：２．非平行入射光引起的偏离３．介质不均匀引起的偏离（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律[例]Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO4-

橙色

黄色

λ1max=350nm

λmax=375nm

λ2max=450nm

化学反应引起的偏离第三节吸光光度法的仪器光度分析的几种方法目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收。选择滤光片的原则：

滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,

即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补。吸光光度法通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光。波长可调，故选择性好，准确度高。一、分光光度计的基本部件0.575光源单色器吸收池检测器显示未考虑吸收池和溶剂对光子的作用分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,

稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

氙灯：紫外、可见光区均可用作光源/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度氙灯氢灯钨灯单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同

玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽色散均匀分辨性能好使用方便－平面透射光栅－反射光栅（广泛使用）吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。

可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池信号显示系统（检流计）：检测光电流强度的大小，并以一定的方式显示或记录下来。

数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。

光电池，光电管，光电倍增管光电管(Phototube)h（片）红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1个光子可产生106～107个电子160-700nm二、吸光度的测量原理检测器接受比色皿透过的光强，转换为电信号，并放大显示，读取T,A光量调节：调T=100%或A=0三、分光光度计的类型单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示特点：使用时来回拉动吸收池→移动误差对光源要求高比色池配对比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器单波长双光束分光光度计特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱双波长分光光度计

特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差光源单色器单色器检测器切光器狭缝吸收池第四节吸光光度法分析条件的选择一、显色反应及其条件的选择（一）显色反应和显色剂

显色反应的选择

灵敏度高，一般ε>104;选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收；对照性好,

max>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好。

显色剂分类

1.无机显色剂

SCN-→Fe3+，MoV

，Co2+

MoO42-→Si，P，V，Ge，As

H2O2→Ti→TiO(H2O2)2+

黄

2.有机显色剂

生色团：分子中含不饱和键基团，吸收波长

λ>200nm的光

–N=N–;C=O；C=S;–NO2;–N=O

助色团：含有孤对电子的基团，与生色团上的不饱和键作用，影响化合物对光的吸收，使颜色加深。

–NH2

；RNH–；R2N–；–OH：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤对电子）neO生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸（二）显色反应条件的选择c(R)c(R)c(R)1.显色剂的用量（c、pH一定）Mo(SCN)32+

浅红Mo(SCN)5

橙红Mo(SCN)6-浅红用量范围宽用量范围窄严格控制显色剂量2.溶液的酸度酸度的影响对显色剂浓度和颜色的影响M+nR=MRnOH-H+存在型体的变化RH=R-

+H+

12生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色实际工作中，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。pHpH1<pH<pH2温度的选择实际工作中，作A~T

曲线，寻找适宜反应温度。ATATATATAT反应时间的选择实际工作中，作A~t

曲线，寻找适宜反应时间。3.时间和温度另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等。4.共存离子的干扰及消除

(1)控制酸度，利用酸效应提高选择性

(2)加入掩蔽剂

(3)利用氧化还原反应，改变干扰离子价态

(4)分离干扰元素

(5)利用参比液消除显色剂、试剂带入的干扰

(6)选择适当的测量波长

Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋

:(掩蔽法)化学法

Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnR

NiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

钴试剂RH+测Co2＋

:(生成络合物性质不同)消除干扰，也可采取分离法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫红）Cu2+pH=2.5SSal测Fe3＋:(控制pH)物理法—选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂/nm/nm二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择100806040200T/%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率读数误差

cc1c1c2c2c3c3><

由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差T

引起的测量误差c/c不同。（一）仪器测量误差检测计标尺上A与T的关系若测A时产生微小的绝对差dA，则相对误差Er为：Er=dA/A；A=εbc，当b一定时，两边积分得：dA=εbdcdc为测量浓度时的绝对误差，二式相除：

dA/A=dc/c=Er

因CA，故dc亦正比dA测量误差公式推导:dA

=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/TA=-lgTTlgT

最大时，即(TlgT)′=0时误差最小,

算得lgT=-0.434,T=36.8%，A=0.4341086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,)（二）测量条件的选择

1.测量波长的选择：最大吸收的原则λmax

2.控制吸光度读数范围：调

c或b，使A介于

0.2----0.8之间。

3.参比溶液的选择:选合适的参比溶液,调仪器

A=0，T=100%。

1.仅络合物有吸收，溶剂作参比。

如phen—Fe2+

标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。

如测汽水中的Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比

例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，

参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：

1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.

--选择适当的参比溶液第五节吸光光度法的应用一、定量分析（一）单组分的测定

1）选择合适的显色反应和显色条件

2）绘出被测组分的吸A

收光谱曲线(用标液)3）在λmax下测一系列标准溶液λ

的A值，绘制工作曲线A---c4）与工作曲线相同的方法，测未知物AX

，从工作曲线上查

cX

Ax

Cx1.一般方法2.示差分光光度法原理：以稍低于待测组分浓度的标准溶液作为参比溶液，然后测试液的吸光度，再从A求c，从而提高准确度。参比液cS<cX样品液

(co<cX)

则AS=εbcSAX=εbcX

A=△A相对=AX-AS=εb(cX-cS)=εb△c相对用cS参比液调“0”，而后测A值，实际是试样与参比之差△A与两者的浓度差△c成正比故：cX=cS+△cX

方法比较常规法以空白溶剂为参比示差法以浓度为Cs

的标准溶液为参比A△C△CxA′常规法TxT051050100

落在测量误差较大的范围示差法T051050100TrTsTs

落在测量误差较小的范围结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度（二）多组分的同时测定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在1,2处分别测得在1处测组分x,在2处测组分yb)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求yc)x,y组分不能直接测定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2)二、络合物组成和酸碱解离常数的测定（一）络合物组成的测定1.摩尔比法:

固定cM

，改变cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

M+nR=MRn2.等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:200.20.40.60.8100.20.40.60.81M+nR=MRn条件稳定常数的测定00.51.0ACM/CA′A′<A0由于络合物离解引起离解度MR=R+M总浓度c平衡浓度c(1-a