第八章 吸光光度法

第8章吸光光度法8.1概述8.2光吸收的基本定律8.3分光光度计8.4显色反应及影响因素8.5吸光光度分析设计8.6吸光光度法的误差8.7常用的吸光光度法8.8吸光光度法的应用2/6/202318.1概述一、光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称~。二、分类：

1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法。

2/6/20232

按能量交换方向分吸收光谱法发射光谱法按作用结果不同分原子光谱→线状光谱分子光谱→带状光谱2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法2/6/202333．光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化

原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变三、发射光谱例：γ-射线；x-射线；荧光2/6/20234四、吸收光谱例：原子吸收光谱，分子吸收光谱吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法基于外层电子跃迁2/6/202358.2光吸收的基本原理8.2.1

吸收光谱产生的原因光:一种电磁波,波粒二象性

光谱名称波长范围X射线0.1~10nm远紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可见光400~750nm近红外光0.75~2.5um中红外光2.5~5.0um远红外光5.0~1000um微波0.1~100cm无线电波1～1000m当光子的能量与分子的E匹配时，就会吸收光子

E=hu=hc/l2/6/20236a跃迁类型

价电子跃迁：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h)顺序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有机化合物的生色原理1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）

E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）

E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）

E较小，λ~200nm

体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）

E最小，λ200~400nm（近紫外区）2/6/20237b生色团和助色团

生色团:含有π→π*跃迁的不饱和基团例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型

→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）2/6/20238助色团:含非键电子的杂原子基团，如-NH2,-OH,-CH3…

与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X2/6/20239物质的颜色吸收光颜色波长范围(l,nm)黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-7508.2.2

物质颜色和其吸收光关系互补色2/6/2023108.2.3

朗伯-比尔定律光吸收定律－朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比2/6/202311当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律－－－光吸收定律

数学表达：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，

K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度注意：平行单色光均相介质无发射、散射或光化学反应2/6/202312摩尔吸光系数e灵敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位：

(L•mol-1•cm-1)c:g/LA=abca:吸光系数2/6/202313桑德尔(Sandell)灵敏度：S

当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。单位：mg/cm2

S=M/e

2/6/202314氯磺酚S测定钢中的铌

50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。有两种做法：根据A=εbc,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

2/6/202315吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和2/6/202316光源单色器样品池检测器读出系统8.3吸光光度计及吸收光谱8.3.1分光光度计2/6/202317常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段2/6/202318单色器作用:产生单色光常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材质：玻璃比色皿－－可见光区石英比色皿－－可见、紫外光区2/6/202319检测器

作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号常用检测器：光电管光电倍增管光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长2/6/202320目视比色法—比色管光电比色法—光电比色计

光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计分光光度法与分光光度计

722型分光光度计光学系统图1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅9.比色池；10.光电管2/6/2023218.3.2吸收光谱吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小

A～l关系1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图2．吸收光谱特征：定性依据

吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生2/6/2023222/6/2023238.4显色反应及影响因素没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－显色反应8.4.1显色反应和显色剂1显色反应络合反应偶氮胂III2/6/202324氧化还原反应离子缔合反应2/6/202325成盐反应褪色反应

Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸2/6/202326吸附显色反应

达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色对显色反应的要求：a.选择性好b.灵敏度高

(ε>104)c.产物的化学组成稳定d.化学性质稳定e.反应物和产物有明显的颜色差别

(l>60nm)2/6/2023272显色剂无机显色剂:

过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：偶氮类：偶氮胂III2/6/202328三苯甲烷类三苯甲烷酸性染料铬天菁S三苯甲烷碱性染料结晶紫

2/6/202329邻菲罗啉类：新亚铜灵肟类：丁二肟2/6/2023303多元络合物混配化合物

Nb-5-Br-PADAP-酒石酸

V-PAR-H2O离子缔合物

AuCl4--罗丹明B金属离子-配体-表面活性剂体系

Mo-水杨基荧光酮-CTMAB2/6/2023318.4.2影响显色反应的因素1溶液酸度（pH值及缓冲溶液）影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl

影响待测离子的存在状态，防止沉淀

影响络合物组成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响2/6/2023322显色剂的用量稍过量，处于平台区3显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定；显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定4显色反应温度加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解2/6/2023335溶剂6干扰离子

有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态选择合适参比

褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰)

选择适当波长2/6/2023348.5吸光光度分析设计

选择检测波长

选择合适的浓度选择参比溶液建立标准曲线测量条件选择2/6/2023358.5.1

吸光度测量的条件选择1测量波长的选择:但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。吸光度测定条件的选择曲线A为钴络合物的吸收曲线曲线B为显色剂的吸收曲线2/6/202336注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰选A=0.2~0.82吸光度读数范围的选择：3参比溶液(空白溶液)的选择：2/6/202337参比溶液的选择一般遵循以下原则：溶液代号在测定波长处有无吸收试液1无无干扰有干扰有显色剂2无有无有其它所加试剂3无有无有（或无）参比溶液2+3或（水)2+31(1+掩蔽)后+2+32/6/2023388.5.2标准曲线制作理论基础：朗伯-比尔定律相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度AA～c作图2/6/2023398.6吸光光度法的误差非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差

对朗伯-比尔定律的偏移2/6/2023408.6.1非单色光引起的偏移复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。2/6/202341非均匀介质

胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯8.6.2物理化学因素离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-化学反应2/6/2023422/6/2023438.6.3吸光度测量的误差2/6/202344若不再此范围：1、改变比色池厚度

2、改变待测液浓度2/6/202345示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度解决高(低)浓度组分(i.e.A在0.2~0.8以外)问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法特点：以标准溶液作空白原理：A相对

=A=bcx-bc0=bc准确度：读数标尺扩展,相对误差减少,

c0愈接近cx,准确度提高愈显著8.7常用的吸光光度法2/6/202346示差分光光度法（示差法）原理

示差法需要较大的入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则：

Ax=bcx

As=bcs

ΔＡ＝Ａx

－Ａs=b(cx－cs）=bΔc

2/6/202347

示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx：

cx=cx测

+Δc示差法标尺扩展原理：T/%Tr/%普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做参比,调T=100%则cx的T=50%；标尺扩展10倍2/6/202348

例：在某光度法测定中，以有色物质的纯溶剂做参比测得A1=bc1

。若以浓度为cs

的该有色溶液做参比，测得A2=bc2。则该有色物质浓度c1

的计算式为:

A2=b(c1cs)2/6/202349用示差分光光度法进行分析测定，以纯溶剂做参比时,某稍低于试液浓度(cx)的标准溶液(cs)的透光度为20%,而试液的透光度为12%。今以上述标准溶液调节仪器的透光度为100%,则试液的透光度将为

60%,这等于将仪器的标尺扩大了

5倍。2/6/2023508.8吸光光度法的应用1测定弱酸和弱碱的离解常数

AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。HB＝H++B-[H+][B-]Ka

=[HB]pKa=pH+lg

[HB][B-]A=AHB+AB-pKa=pH+lg

AB-

-AA-AHBlg

AB--AA-AHB对pH作图即可求得pKa

2/6/2023512/6/2023522络合物组成确定

饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌3.0×10-5mol/L(固定