生物固定技术

生物分子固定化技术及应用―—载体、活化2014.06.23载体对载体的要求：1、表面具有化学活性基团2、具备一定的容量3、惰性好4、良好的生物相容性5、足够的稳定性6、合适的粒度和孔径结构（亲和色谱）7、廉价易得载体材料类型：无机载体材料天然有机高聚物合成有机高聚物膜磁性微球无机载体材料：硅胶：机械强度好、容量高，但PH稳定性差、残余的硅醇羟基可造成非特异性吸附可控孔玻璃（CPG）：质地硬、孔径均匀、重复性好、不易受腐蚀，但未经修饰的CPG对蛋白质有较强的非特异性吸附玻碳材料：化学稳定性高，热胀系数小，质地坚硬，气密性好，电势适用范宽其他:金、铂、氧化铝等等天然有机高聚物：纤维素：廉价、稳定性好，但易受PH及离子强度影响琼脂糖凝胶：良好的惰性、非特异性吸附低、易活化、容量高，但机械强度和稳定性差葡聚糖凝胶：交联度可控、可耐高温、可活化羟基多，是完整细胞分离的理想载体脂质体：生物相容性好，导向性好微生物表面呈观：使用基因工程的方法以活微生物作载体将蛋白质分子表达于微生物表面其他：如变性胶原微载体―培养贴壁细胞，白蛋白微球―制备载体药物合成有机高聚物：丙烯酰胺衍生物：化学稳定性好、抗微生物侵蚀、非特异性吸附低，但机械稳定性差、网孔过小甲基丙烯酸衍生物：机械和化学稳定性好，其中聚甲基丙烯酸羟乙酯还可作为细胞培养的微载体聚苯乙烯类：抗原抗体可通过疏水吸附包被在聚苯乙烯微孔板上，是非均相免疫分析中普遍使用的免疫反应剂和分离剂，但对小分子肽物理吸附效果差聚四氟乙烯（塑料王）：化学稳定性极强、不溶于水和有机溶剂、耐热其他：聚酰胺、聚乙烯醇、聚氨基甲酸酯等在生物传感探头的制备中具有重要作用磁性微球：一种特殊的生物固定化载体，可用于细胞分离、基因操作、免疫分析及固定化酶等领域，由于其颗粒较小，因而可在体系中稳定的悬浮，易于进行亲和性结合或进行催化反应;顺磁性使其固液分离更加操作方便。3个评价磁珠性能的方面：悬浮稳定性与顺磁性表面性能，必须有足够的化学活性基团用来偶联，此外，表面性能如Zeta电位、表面疏水性及水化层厚度等也直接影响其性质均一性，保证各磁性微球对外磁场响应的同步性、生物分子偶联容量的稳定性和实验的可重复性磁性材料：Fe、Co、Ni等过渡金属特定晶型的氧化物和混合氧化物及水化物活化活化方法的原则：活化方法应能防止结合到载体上配基的漏失没有非特异性吸附载体的产生不应改变载体的性质产生快速有效的配基偶联活化方法容易进行活化方法具有可重复性几种常见基团的活化方法：氨基活化巯基活化羰基活化羟基活化活泼氢的活化光交联反应氨基活化方法：溴化氰（CNBr）法N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）活化法羰基二咪唑（CDI）活化法还原氨化法FMP活化法碳二亚胺（EDC）法有机磺酰氯法二乙烯基砜（DVS）法吖内酯法氰尿酰氯（TST）法溴化氰法：用于含羟基载体，可偶联小配基，操作简单也容易重复，偶联蛋白时比较温和；有少量持续的偶联配基脱落N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）活化法：可用来活化琼脂糖凝胶、金箔电极和载体偶联配基N,N’-琥珀酰亚胺酸酯（DCS）碳二亚胺（EDC）法：加速羧酸和氨基之间酰胺键的形成，是零长度交联剂，广泛应用于偶联反应巯基活化方法：碘乙酰和溴乙酰活化法马来酰亚胺法吡啶二硫化物法二乙烯基砜法环氧法TNB-硫醇活化法碘乙酰和溴乙酰活化法：马来酰亚胺法：广泛的用作加速蛋白质或多肽中的巯基共轭交联，通常马来酰亚胺在一个双功能交联剂的一端，通过两步反应把蛋白质的功能基结合到另一个巯基上羰基活化方法：酰肼活化法还原氨化法酰肼活化法：含醛或酮基的配基与酰肼的偶联是通过稳定的腙键形式，该方法还可固定糖蛋白还原氨化法：对直接共价结合脂肪醛、酮、还原糖或蛋白质的氨基具有多向选择性羟基活化方法：环氧化物活化方法二乙烯基砜（DVS）法氰尿酰氯法环氧化物（二环氧乙烷）活化方法：二环氧乙烷能在羟基聚合物中引入环氧乙烷基，1,4-丁二醇二缩水甘油醚经常用来导入这些基团，广泛的用于偶联单糖和低聚糖以及含有仲胺的配基活泼氢的活化方法：偶氮反应曼尼期缩合法偶氮反应：偶氮衍生物能够同带有酚羟基或咪唑基团反应，快速的产生可逆的偶氮键，活化载体通常是从手臂分子末端的对氨基苯烷基团开始制备光交联反应：芳环偶氮基团