生化工程下游技术-课件-第8章

第八章反胶团萃取

第一节概述

第二节反胶团的构造与制备

第三节反胶团萃取原理

第四节反胶团的应用

第五节反胶团萃取设备

第一节概述传统的分离方法(如溶剂萃取技术)难以应用于蛋白质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对象－蛋白质等绝大多都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。优点：反胶束萃取具有成本低溶剂可反复使用萃取率和反萃取率都很高反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。反胶团萃取技术在分离蛋白质方面的优点

（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；（2）分离、浓缩可同时进行，过程简便；（3）能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；（4）由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；（5）反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。正胶团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”有机溶剂极性“头”极性的“核”非极性“尾”反胶团的优点在疏水性环境中的形成极性“水核”具有较强的溶解能力。生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能水壳模型蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上蛋白质被几个微胶团所溶解，微胶团的非极性尾端与蛋白质的亲脂部分直接作用反胶团溶解蛋白质的形式第二节反胶团的构造与制备一、反胶团的构造：

向非极性溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。反胶团溶液形成的关键:表面活性剂的存在

1、不同表面活性剂聚集体2、表面活性剂

表面活性是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子(1)阴离子型表面活性剂：AOT（AerosolOT),

其化学名称是琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸钠(2)阳离子型表面活性剂：CTAB溴代十烷基三甲铵(3)非离子型表面活性剂AOT具有双链，极性基团较小，形成反胶团时无需添加辅助表面活性剂，所形成的反胶团空间较大(半径170nm)，有利于生物大分子进入。AOT

的分子结构，化学名为丁二酸－2－乙基己基磺酸钠AOT-异辛烷-水体系：萃取条件：pH8左右，KCl0.2mol/L反萃取条件：pH12左右，KCl1.0mol/L(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴需加入助溶剂，以提高堆砌率[(v/L)/a>1].将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。这是因为它们在结构上的差异造成的。(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵3、反胶团的分类1)单一表面活性剂反胶团体系：是指在使用时无须假如助剂的表面活性剂，具有多条中等长度的烷基尾和一个较小的极性头。

a:阴离子型表面活性剂，如AOT。该体系结构简单和稳定，反胶团体积较大，适用于等电点较高的、相对分子量较小的蛋白质的分离；

b:阳离子型表面活性剂（如CTAB，DAP）等。该体系适用于等电点较低的、相对分子量较大的蛋白质的分离；

c:非离子型表面活性剂能形成更大的反胶团体系。能分离相对分子量更大的蛋白质，但这类体系容易乳化。2)混合表面活性剂反胶团体系：是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系，一般来说，混合表面活性剂反胶团对蛋白质有更高的分离效率。3)亲和反胶团体系：是指除了有组成反胶团的表面活性剂以外，还有具有亲和特征的助剂，它的亲和配基与蛋白质有特异的结合能力，往往极少量亲和配基的加入就可使萃取蛋白质的选择性大大提高。二、反胶团的物理化学特性及制备

1、反胶团的物理化学特性：表面活性剂和非极性有机溶剂的种类、浓度；操作时体系的温度、压力；微小水池中的离子强度等，都会影响反胶团的大小。（1）反胶团的临界胶团浓度（CMC）：表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度。

C水

W=----C表反胶团的大小以及反胶团内微水相的物理化学性质因反胶团含水率W的不同而差别很大。如表面活性剂是AOT，则：W＝C水/CAot，W是个非常重要的参数，W越大，反胶团的半径越大。

（2）反胶团含水率W：W用水和表面活性剂的浓度之比来定义，即

当W

<6-8时，“水池”中水的其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，疏水性非常强，另外，其冰点通常低于0℃。当W

>16（<40)时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成二重电荷层，W.max=60，若W值再增大，反胶团溶液变浑浊，并开始分层。

“水池”中水与普通水的差异：二、反胶团的制备：

制备反胶团系统一般有以下三种方法：

（1）注入法：将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。

（2）相转移法：把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机相。

（3）溶解法：将含有反胶团（W0＝3－30）的有机溶液与蛋白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中。

第三节反胶团萃取分离原理

宏观上,反胶团萃取，是有机相－水相间的分配萃取，即与液液萃取在操作上具有相同特征。

。一、原理微观上，是从主体水相向有机溶剂相中的反胶团微水相中的分配萃取特点：（1）萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性，失活。（2）pH、离子强度、表面活性剂浓度等（如表8.1所示）因素会对反胶团萃取产生影响。通过对它们的调整，对分离场（反胶团）－待分离物质（生物大分子等）的相互作用加以控制，能实现对目的物质高选择性的萃取和反萃取。（3）反胶团中微水相体积最多仅占有机相的几个百分点、所以它同时也是一个浓缩操作。二、影响反胶团萃取蛋白质的主要因素

（1）水相pH值的影响：

水相的pH是影响反胶团萃取蛋白质的最主要因素。

表面活性剂的极性头是朝向反胶团的内部，是反胶团的内壁带有一定的电荷，而蛋白质是一种两性电解质，水相的pH值决定了蛋白质分子表面可电离基团的离子化程度，当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。相反，当水相pH大于等电点时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃取。

蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶团的大小有关，所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。

以表8.2所示的酶、蛋白质为例，考察萃取或反萃取时静电性相互作用以及pH对这种作用的影响。

AOT-异辛烷-水体系

例：小分子蛋白质

当pH>pI时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pH<pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。

不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成

增大(pH-PI)值的绝对值促进相转移蛋白质的相对分子质量Mr与(pH-pI)绝对值呈线性关系（2）水相离子强度的影响：

离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的:

a.离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中；c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来；d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。

添加KCl等无机盐，因离子强度的增加和静电屏蔽的作用，而使静电性相互作用变弱，一般地，萃取率下降

添加KCl等无机盐，对有机相具有脱水作用（W0减小），使立体性相互(排斥)作用增大，萃取率有下降趋势。（3）助表面活性剂的影响：

蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解较大相对分子质量的蛋白质。

（4）溶剂体系的影响：

溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有影响，常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷等），有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。（5）表面活性剂种类及浓度的影响选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，应以蛋白质萃取率最大为最佳浓度。（6）温度的影响温度的变化对反胶束系统中的物理化学性质有激烈的影响，增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度，例如增加温度可使α-胰凝乳蛋白酶进入NH4-氯仿相并在转移率上分别增加50％。第四节反胶团萃取的应用

一、分离蛋白质混合物

第一步：在pH=9和较低的盐浓度下，核糖核酸酶-a带负电荷，不能被反胶团萃取，留在水相中，而细胞色素C和溶菌酶由于都带正电荷，被萃取到反胶团中。第二步：利用提高离子强度，将细胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反胶团中。第三步：进一步提高pH值和离子强度，将溶菌酶反萃到水相中。因此，通过调整pH，进行正萃取分离，通过控制KCl浓度，反萃取分离，能获得较好的分离效果和收率。

二、浓缩α-淀粉酶

使用如图8.14所示，用2个混合槽和2个澄清槽组成连续萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v)辛醇－异辛烷的反胶团体系循环萃取分离α-淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水平上，使失活速度很小，将α-淀粉酶浓缩了8倍，酶活力损失约30%。对该过程优化，在反胶团中加入非表面活性剂，以提高分配系数，同时加大搅拌速度，以提高传质速率，反萃液中α-淀粉酶的活力回收率为85%，浓缩了17倍。三、直接提取胞内酶：

用反胶团萃取直接从全发酵液中提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶：将全细胞的悬浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/己醇-辛烷反胶团溶液中，完整的细胞在表面活性剂的作用下，析出酶进入反胶团的“水池”中，经反萃取，可选择性地回收浓度很高的酶。该技术不利的一面是细胞碎片留在反胶团中，使得反胶团不能循环利用，但如果能够便利地回收有机溶剂和表面活性剂，那么这种细胞溶解和蛋白质萃取相结合的工艺方法，将成为从细胞中直接提取蛋白质的重要途径。四、反胶团萃取用于蛋白质的复性

反胶团萃取的一个引人注目的应用是蛋白质的复性。重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，以便从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过程通常要在极稀的溶液中进行，以避免部分复性中间体的凝集。利用反胶团包裹变性的蛋白质，通过调整系统组成的环境参数，使得每个微胶团只包裹一个蛋白质分子，然后改变胶团溶液组成进行复性，由于蛋白质被单独装在各个胶团中，复性时完全不接触，避免了有害作用，使酶的活性完全恢复。

五、从植物中提取油和蛋白质

用烃类有机溶剂对植物种子进行反胶团萃取，油被直接萃入有机相，蛋白质却萃入反胶团的“水池”中。先用水溶液反萃取得到蛋白质，溶液再经冷却使表面活性剂沉淀分离，最后用蒸馏的方法将油和烃类分离。实验证明该方法相当优越。

六、反胶团萃取蛋白质的过程开发1、新型反胶团体系

AOT不能分离分子量大的蛋白质且沾染产品，需选择更优良的表面活性剂。2、蛋白质的反萃取目前的回收方法回收率低，对活性有伤害。3、反胶团萃取的工业化存在问题：沾染、工业放大的基础数据缺乏、放大模拟的理论模型的建立。第五节反胶团萃取设备

要实现反胶团萃取的工业化，关键之一是开发适用于反胶团萃取的高效分离设备1、膜萃取器：膜萃取器有管状超滤膜和中空纤维膜两种（1）管状超滤膜用管状陶瓷超滤膜截留含有磷脂酶的反胶团，实现了对生物产品的部分分离。含有磷酯酶的发酵液经过泵进入到陶瓷超滤膜组件中，磷酯酶被截留在膜内，萃余相则返回到反应器，从而实现磷酯酶的分离。（2）中空纤维膜

中空纤维管是另一类被广泛用于液-液分离的膜萃取器。它具有很大的比表面积，且与反胶团技术相结合能减少蛋白质的失活，是一项很有实用前景的生物分离技术。将亲和配基（活性色素辛巴蓝）加入到大豆卵磷酯-正已烷系统中，制成亲和反胶团相，并将此胶团相固定于聚丙烯中空纤维膜内，从而构建起亲和反胶团萃取膜的分配色谱装置（AMPC）。2、离心萃取器

反胶团溶液-水-蛋白质所组成的萃取体系，由于表面活性剂的存在，界面张力低，易乳化。另外，