长期定位施肥对石灰紫色土真菌特性的影响

四川农业大学◎硕士学位论文答辩姓名：李芳指导老师：张小平教授专业：土壤学长期定位施肥对石灰性紫色土主要内容选题背景及依据1研究目的意义及技术路线2材料与方法3结果与分析4致谢5第一部分选题背景及依据

是影响土壤质量及其可持续利用最深刻的农业措施之一，会对土壤结构、生物肥力和生产力产生重要影响。我国一种特有的土壤资源，分布面积广泛。可分为酸性紫色土、中性紫色土和钙质紫色土。分解植物残体，释放维持植物生长的营养。促进植物生长，防御植物病害等，也可造成植物病害。紫色土施肥真菌前人土壤理化性质，作物产量生物学角度？表型分析分子足迹多样性群落结构动态变化选题背景及依据第二部分研究目的意义及技术路线

利用表型分析和“分子足迹”技术研究不同施肥制度对石灰性紫色土相关真菌特性和土壤活性的影响，可以为在该类土壤上建立长效合理施肥制度，保护土壤真菌，维持土壤质量提供理论依据。本试验通过采集遂宁长期定位施肥试验田内的土壤，通过传统的实验室培养方法和现代分子生物学方法的有机结合，旨在研究在不同施肥方式和不同作物种类下石灰性紫色土真菌生物量和群落结构的多样性，为长期定位施肥下石灰性紫色土中真菌对土壤质量方面的影响提供科学依据。

研究目的、意义创新点第二部分研究目的意义及技术路线技术路线土样采集样品处理富集培养长期定位施肥对石灰性紫色土真菌特性的影响群落结构分析分离计数分类生物量测定群落结构分析侵染率测定孢子分离鉴定理化性质分析真菌分析AMF分析

第三部分材料与方法丛枝菌根真菌（AMF）培养鉴定方法

丛枝菌根真菌（AMF）侵染率测定方法

真菌和AMF群落结构PCR-DGGE测定方法

真菌数量及生物量测定方法

土壤理化性质分析研究区概况和土样采集第三部分材料与方法12345678无肥NN,PN,P,K农肥(M)农肥(M),N农肥N,P农肥,N,P,K整个试验小区之间用水泥板隔开，留有排水沟。

名称：氮、磷、钾长期定位肥料试验

面积：总面积：2亩，小区面积：0.2亩。土壤类型：原生钙质紫色土试验开始时间：1982年。

研究区域概况施肥处理轮作方式：水稻-小麦。

采集于四川省遂宁市船山区的石灰性紫色土壤采样时间2009.5小麦收割后

2009.10水稻收割后采样方法梅花形采样法一部分样品立即用于VA菌根的富集培样一部分放于室内风干，用于土壤基础理化性质的分析另一部分新鲜土壤研磨过筛后，装入无菌袋中，置于4℃冰箱保存，以供可培养真菌分离与计数，生物量分析和群落结构分析土样采集第三部分材料与方法采用常规分析方法土壤理化性质的测定pH，有机质，全氮，碱解氮，全磷，速效磷，速效钾真菌数量分析AMF多样性分析培养基马丁氏培养基分离与计数平板稀释法分类

真菌鉴定手册真菌生物量分析高效液相色谱测定土壤中麦角甾醇来反映其生物量真菌细胞膜双层结构的重要组成成分加富培养孢子分离改进的湿筛-蔗糖梯度离心法种的鉴定VA菌根真菌鉴定手册侵染率测定KOH-透明法第三部分材料与方法试验方法采用FastDNASPINKitForSoil(Bio-RadCo.)的试剂盒方法微生物总DNA的提取PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析18SrDNA的PCR扩增土壤总DNA提取

真菌18SrDNA的PCR扩增PCR反应程序参考Smit的方法AMF18SrDNA的PCR扩增采用Nested-PCR程序用第三次PCR纯化产物进行DGGE，采用变性梯度为20％～50％的8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染法对凝胶进行染色。DGGE指纹图谱分析借助于Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行条带判读、迁移率、强度计算及聚类分析。土壤真菌和AMF群落结构的PCR-DGGE方法

第三部分材料与方法数据处理Shannon-Wiener指数(H)

EH=H/Hmax=H/lnSPi为某一条带的强度与同泳道中所有条带总强度的比值，S为每一泳道总的条带数。

真菌计数：每克干土中菌数=菌落平均数×稀释倍数/干土%。种的丰度：SR=AM真菌总种次数/土壤样本数。孢子密度：SD=某采样点所有土样中AM真菌孢子级数/该点土样数。频度计算：F=（某属或种的出现次数/土样数）×100%。相对多度公式：RA=该采样点AM真菌某属或种的孢子数/该采样点总孢子数×100%.AM菌根侵然率=∑（0%×根段数+10%×根段数+20%×根段数+…+100%×根段数）/观察总根段数。第三部分材料与方法结果与分析第四部分结果与分析土壤理化性质真菌数量生物量AMF多样性指数PCR-DGGE分析土样名pH有机质(g/kg)全量N、P、K（%）有效量N、P、K、Mn、B、Mo、Zn、缓效K（mg/kg）全氮全磷全钾碱解氮有效磷有效钾缓效钾有效锰有效硼有效钼有效锌钙质紫色土8.615.90.1090.1352.68966.33.9130.6699.46.90.180.060.74钙质紫色土定位试验田的养分状况小麦栽培土壤样品主要理化性质下降增加第四部分结果与分析·土壤理化性质

项

目编

号pH水分（%）全氮（%）水解氮（mg/kg）有效磷（mg/kg）速效钾（mg/kg）有机质（mg/kg）M8.124.5850.1712105.211.36149.52.323NM8.234.8870.1706104.512.18117.12.442NPM8.114.2320.1668108.567.36120.82.703NPKM8.094.2090.1770127.169.27149.72.775CK8.244.1730.138490.8810.93181.62.084N8.164.4830.213288.728.766151.32.328NP8.094.0750.1496101.866.03118.82.604NPK8.084.4870.1798121.651.51140.32.612水稻栽培土土壤样品主要理化性质下降增加PH：7.50-8.24，属于偏碱性范围

有效磷的含量较高

第四部分结果与分析·土壤理化性质项

目编号pH水分（%）全氮（%）水解氮（mg/kg）有效磷（mg/kg）速效钾（mg/kg）有机质（mg/kg）M7.504.0430.158684.9511.40164.52.126NM8.133.9930.163799.9412.79132.02.340NPM8.094.9870.1599114.567.61105.62.571NPKM7.984.0570.1781110.872.50191.42.537CK8.203.9690.146977.3211.45153.72.067N8.224.9900.2132103.414.26128.12.266NP8.023.9420.1654102.853.71156.72.524NPK8.023.7530.1591108.358.55175.52.728有机质的含量：2.067（CK）-2.775(MNPK)mg/kg

NPK肥处理中真菌数量明显增加

农家肥配施N肥真菌数量达到最高长期不同施肥对石灰性紫色土可培养真菌数量的影响第四部分结果与分析·真菌数量图1不同施肥处理下可培养真菌数量Fig.1ThenumberofsoilfungusondifferentfertilizertreatmentsCKNNPNPKMMNMNPMNPK真菌数量：小麦种植土>水稻种植土鉴定出的真菌种类第四部分结果与分析·真菌种类共鉴定出4属的真菌，包括青霉属（Penicillium）木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和被孢霉属（Mortierella）。青霉属曲霉属被孢霉属木霉属作物Crops青霉属Penicillium木霉属Trichoderma曲霉属Aspergillus被孢霉属Mortierella小麦水稻48.144.740.721.344.414.918.519.1石灰性紫色土中真菌各属的频度小麦种植土青霉属最高被孢霉属

最低频度水稻种植土青霉属最高曲霉属最低第四部分结果与分析·真菌·频度

配置5ug/ml麦角甾醇标样，采用反相C18柱（4.6×250mm），流动相为甲醇，流速1ml/min，进样量为10ul，测出麦角甾醇标样的出峰时间。

按照20，10，5，2.5，1.25，0.625ug/ml的浓度配成麦角甾醇标准溶液，按照上述色谱条件，以麦角甾醇浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，测出他们的线性方程。不同施肥处理对土壤真菌生物量的影响

液相色谱法第四部分结果与分析·真菌·生物量第四部分结果与分析·真菌·生物量图2麦角甾醇标样色谱图Fig.2HPLCofergostrolstandard图3麦角甾醇标准曲线Fig.3standardcurceofergostrol长期不同施肥处理对土壤真菌生物量的影响

第四部分结果与分析·真菌·生物量真菌生物量种植不同作物也有影响MNP配施，真菌的生物量最高，达到40.835ug/ml。

无机肥配施有机肥提高真菌的生物量CKCKNNPNPKMMNMNPMNPK不同施肥处理对真菌生物量的影响第四部分结果与分析·真菌·群落结构长期不同施肥处理对土壤真菌群落结构的影响小麦种植土水稻种植土真菌18SrDNA的DGGE指纹图谱分析

农家肥加无机肥的处理条带数多于单独施加无机肥的处理

小麦种植土中条带数和颜色浓度均高于水稻种植土条带最少颜色最浅施肥处理TreatmentShannon指数Shannon'sdiversityindex(H)丰富度Richness均匀度Evenness(EH)小麦水稻小麦水稻小麦水稻CK2.172.07980.9890.994N2.762.051680.9960.986NP2.192.18990.9970.991NPK2.552.051380.9940.987M2.382.4311120.9970.979NM2.552.241370.9980.972NPM2.301.841040.9960.945NPKM2.301.331080.9990.963不同施肥处理下石灰性紫色土真菌群落基因多样性指数

小麦种植土>水稻种植土添加磷肥的低于无磷肥的处理农家肥+无机肥的处理略低于无机肥的处理第四部分结果与分析·真菌·群落结构真菌群落多样性的聚类分析

小麦种植土中真菌的DGGE聚类图

水稻种植土真菌的DGGE聚类图

MNPK

NP

NPKMNP

CK

NMN

MNNPKCKNPMNPMNPKMNM相似度高说明其中含有的真菌的种类最接近种植不同作物，施肥能使土壤中真菌的种族发生变化第四部分结果与分析·真菌·群落结构小结表型分析——数量、生物量分子足迹——群落结构相对于无肥处理而言，长期施肥可以提高土壤可培养真菌生物量和种群丰富度，其中农家肥的施用比单独施用无机肥中的真菌增加的更多；8种施肥处理中，长期氮磷化肥与有机肥配合施用处理(NPM)的土壤真菌生物量和种群最高。以对照组的无肥处理（CK）最低。对于种植不同作物而言，小麦种植土中真菌生物量和种群比水稻种植土中的高。第四部分结果与分析·真菌·小结不同施肥处理对石灰性紫色土中丛枝菌根真菌（AMF）的影响第四部分结果与分析·丛枝菌根真菌·侵染率处理CKNNPNPKMMNMNPMNPK小麦土16.40b17.67a0.00e0.23e4.67d10.60c0.00e0.23e水稻土14.50a9.77b0.00d0.43d2.60c3.30c0.13d0.53d不同施肥处理土壤中AMF的根系侵染率

农家肥、磷肥对AMF侵染率的影响较大被AMF侵染的根系被AMF侵染的根系侵染根系的菌丝分离出的AMFAMFx1x2x3x4x5x6x7x8s1s2s3s4s5s6s7s8A.denticulateA.excavateA.tuberculataAr.leptotichaE.schnckiiG.albidumG.bireticulataG.caledoniumG.constrictumG.dimorphicumG.etunicatumG.geosporumG.manihotisG.mosseaeG.multicauleG.tortuosumG.versiforme

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++第四部分结果与分析·分离出的丛枝菌根真菌

共分离出17种AMF，球囊霉属(Glomus)12种，占70.5%，无梗囊霉属（Acaulospora）3种，占17.6%，原囊霉属（Archaeospora）和内养囊霉属（Entrophospora）各1种，各占5.9%。注：x代表种植小麦后采集的土壤，s代表种植水稻后采集的土壤，1-8代表8种不同的施肥处理，+代表出现了该种，空白表示未出现该种。AMF的形态特征施肥处理Tretment种的丰度

孢子密度(级.50g土-1)Speciesrichnesssporedensity(Grad.50gsoil-1)小麦土(Wheat)水稻土(Rice)小麦土(Wheat)水稻(Rice)CKNNPNPKMMNMNPMNPK1294927864128754725734721434126854126854227444726作物Crops球囊霉属Glomus无梗囊霉属Acaulospora原囊霉属

Archaeospora

内养囊霉属Entrophospora小麦水稻77.677.515.517.53.52.53.52.5不同施肥处理下石灰性紫色土中AMF种的丰度和孢子密度AMF各属的频度

第四部分结果与分析·AMF·丰度频度AMF种的丰度、密度：无机肥处理>添加农家肥土壤小麦种植土>水稻种植土处理Treatments球囊霉属Glomus无梗囊霉属Acaulospora原囊霉属

Archaeospora

内养囊霉属EntrophosporaCK52.2041.76.0N100000NP64.535.500NPK100000M49.250.800MN59.540.500MNP53.446.600MNPK57.342.700处理球囊霉属Glomus无梗囊霉属Acaulospora原囊霉属

Archaeospora

内养囊霉属EntrophosporaCK60.2027.012.8N69.1030.90NP62.537.500NPK59.540.500M81.118.900MN76.416.007.6MNP53.846.200MNPK72.927.100小麦根围AMF各属的相对多度

水稻根围AMF各属的相对多度

第四部分结果与分析·AMF·相对多度长期定位施肥对石灰性紫色土AMF群落结构的影响AMF的18SrDNA的DGGE指纹图谱分析水稻种植土小麦种植土无机肥配施农家肥的处理比无机肥处理的条带数多，颜色更深DGGE条带在箭头所指处的条带表现为缺失，说明施磷处理会导致土壤中的AMF某些特异种群的消失31第四部分结果与分析·AMF·群落结构2施肥处理TreatmentShannon指数Shannon'sdiversityindex(H)丰富度Richness均匀度Evenness(EH)水稻小麦水稻小麦水稻小麦CK2.382.7213180.9290.941N2.572