转基因食品安全分析-课程-第四部分转基因生物安全管理与检测

第四章

转基因生物安全管理与检测转基因农作物种植情况转基因生物安全管理转基因产品检测技术主要内容转基因农作物种植情况1996-2011年全球转基因作物增长趋势1.48亿公顷，占全球农作物种植面积的10%主要转基因作物种植情况大豆玉米棉花油菜主要转基因农作物种植比例常规作物转基因作物转基因农作的主要性状转基因农作物种植分布2010年全球转基因植物面积达到1.48亿公顷,涉及24种作物184个品系，种植国家有29个，发达国家占10个。共有59个国家批准转基因作物的种植和进口，包括美国、日本、加拿大、墨西哥、澳大利亚、南非、欧盟、中国等。玉米最多有60个品系批准应用，其次是棉花（35）、油菜（15）、大豆（14）。转基因安全管理国际组织对转基因生物安全管理国际食品法典委员会（CAC）联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）于1963年联合创立的，其职责在于保护消费者健康，保证开展公正的食品贸易和协调所有食品标准的制定工作。最早提出应用风险分析原则进行食品安全管理。165个成员国。1999年食品法典委员会建立了政府间特设生物技术食品工作组,在转基因领域制定风险分析原则和指南2000年发布了《关于转基因植物性食物的健康安全性问题》的文件，运用“实质等同性”概念建立有效的安全性评估框架。/web/index_en.jsp并于2003年7月1日，在罗马召开的联合国食品标准署会议上，国际食品法典委员会通过了三项有关生物技术食品的原则和准则，即“现代生物技术食品风险分析原则”（CAC/GL44-2003）“重组DNA植物食品安全评估准则”（CAC/GL45-2003）“重组DNA微生物食品安全评估准则”（CAC/GL46-2003）食品法典委员会设立了食品标签法规委员会(TheCodexCommitteeonFoodLabelling，CCFL)2006年CCFL第34届会议上通过建议一个实体工作组（physicalWorkingGroup）讨论转基因食品标识的主要问题国际食品法典委员会（CAC）经济合作与发展组织（OECD）经济合作与发展组织，简称经合组织（OECD），是由34个市场经济国家组成的政府间国际经济组织，旨在共同应对全球化带来的经济、社会和政府治理等方面的挑战，并把握全球化带来的机遇。1986年，蓝皮书《重组DNA安全性考虑》—转基因生物总体指南1992年，《生物技术安全性考虑—1992》—明确生物安全的概念和原则1992年，《生物技术作物田间试验安全考虑》—确定分阶段原则和个案原则1993年，《现代生物技术加工食品风险评估概念和原理》—实质等同原则，现在有67个国家把这一原则作为转基因食品安全评估的基本原则。1995年以来，风险评估信息共享，已出版65个生物安全共识文件/topic/0,3699,en_2649_34385_1_1_1_1_37401,00.htm国际标准化组织(InternationalOrganizationforStandardization,ISO)是一个全球性的非政府组织，1946年成立于瑞士日内瓦,负责制定在世界范围内通用的国际标准,ISO现有117个成员，包括117个国家和地区。ISO转基因食品检测标准技术委员会（ISOTC34/SC16），主管转基因食品国际标准的制修订工作。技术委员会负责起草国际标准，通过一致的标准来消除现存的贸易壁垒，推进国际商品和服务的交流。目前为止，ISO制订6个转基因生物产品检测标准。转基因产品成分检测ISO标准一般性原则和要求蛋白检测采样核酸检测核酸提取定性PCR检测定量PCR检测核酸检测方法增补原则ISO24276:2006，Generalrequirementsanddefinitions

ISO21571:2005Nucleicacidextraction

ISO21570:2005QuantitativenucleicacidbasedmethodsISO21572:2004ProteinbasedmethodISO/TS21098:2005InformationtobesuppliedandprocedurefortheadditionofmethodstoISO21569,ISO21570orISO21571prENISO21568:2005Sampling21569:2005

Qualitativenucleicacidbasedmethods发达国家转基因生物安全管理规定各国均以风险分析为基础，理念、内容、方法无明显差异，不同的战略选择和政策导向形成不同的管理模式—美国模式，以产品为基础，风险分析中应用“可靠科学原则”只要在科学上无法证明它有危险性，就不应该限制—欧盟模式，以过程为基础，风险分析中应用预防原则只要不能否定其危险性，就应该限制—日本模式，以过程为基础，风险分析中应用“可靠科学”美、欧、日等，重视转基因生物的安全管理，通过立法和技术指南规范研发和应用行为欧盟转基因生物安全管理

法律体系分为指令Directive和法规Regulation两个层次，颁布的法令在各国采纳后对采纳的国家有效，颁布的法规则直接有效。按照预防原则对转基因生物进行单独立法管理欧洲食品安全局负责风险评价，负责GMOs的审批和市场投放,实施从农田到餐桌的的各环节进行监控，保证转基因产品的可追溯性指令2001/18/EC《转基因生物有意环境释放》—规范任何可能导致转基因生物与环境接触行为法规1829/2003/EC《转基因食品和饲料管理条例》—转基因食品审批和执行制度法规1830/2003/EC《转基因生物追溯性及标识办法以及含转基因生物成分的食品及饲料产品的追溯性管理条例》—转基因食品追踪和标识制度欧盟法规美国转基因生物安全管理1976年，国家卫生研究院（NIH）《重组DNA分子研究指南》全球首个转基因技术安全管理法规全球首个转基因技术安全管理法规，对重组DNA研究项目的进行审查、评价和监控1986年颁布了《生物技术法规协调框架》将基因工程工作纳入现有法规进行管理，由农业部、环保署和食品药品管理局在现有的法规框架下协调管理转基因生物。农业部（USDA），管理目的是确保转基因生物（GMOs）的安全种植。有两个机构涉及该项工作，即：动植物检疫局（APHIS）和食品安全及检查局（FSIS）。环保署（EPA），负责管理转基因生物的环境释放。依照《联邦杀虫剂、杀菌剂、杀鼠剂法》、《联邦食品、药物和化妆品法》对杀虫剂（包括植物杀虫剂，即转抗虫、抗病基因产生的蛋白质）进行管理。具体负责杀虫剂对农业的影响和确定或免除杀虫剂在食品中最高残留量的管理。食品与药物管理局（FDA），依照《联邦食品、药物和化妆品法》，负责食品和食品添加剂的安全管理，确保所转基因生产的蛋白质对人类健康的安全。--负责食品标识管理。美国管理部门日本转基因生物管理、法规

日本在1979年制定了《重组DNA实验管理条例》，开始生物技术的安全管理。所涉及的部门主要是科学技术厅、通产省、农林水产省和厚生劳动省。科学技术厅：依照《重组DNA实验准则》，规范实验室和封闭温室的研究，负责审批试验阶段的重组DNA研究。厚生劳动省（MHLW)：依照《重组DNA准则》，负责对重组DNA技术生产药品和食品的管理-食用安全。通产省（MITI)。：依照《遗传工程体工业化准则》，对将重组DNA技术的成果应用于工业化活动进行管理-饲料安全。农林水产省（MAFF）：依照《农、林、渔及食品工业应用重组DNA准则》负责管理GMO在农业、林业、渔业和食品工业中应用-环境、饲料安全。MAFF和MHLW分别颁布了食品标识体系，规范转基因食品标识标准。中国法律法规和制度要求特点：与国际组织及多数国家的理念、要求、做法一致中国生物安全网，/biosafety/jsbz/2001年，国务院《农业转基因生物安全管理条例》2002年，农业部《农业转基因生物安全评价办法》2002年，农业转基因生物进口管理办法》2002年，农业转基因生物标识管理办法》2006年，农业转基因生物加工审批办法》

2004年，质检总局《进出境转基因产品检验检疫管理办法》

——一个《条例》，5个办法规范了农业转基因生物安全评价、进口安全管理、标识管理、加工审批、产品进出境检验检疫工作，形成了一整套适合我国国情并与国际接轨的法律法规、技术规程和管理体系。我国的法律法规制度国务院部际联席会议，由农业、科技、环境保护、卫生、外经贸、检验检疫等有关部门负责人组成。农业部农业转基因生物安全领导小组农业部科技教育司（农业部农业转基因生物安全领导小组办公室）国家农业转基因生物安全委员会及其秘书处管理机构农业部科技发展中心（农业部农业转基因生物安全监管中心、农业部植物新品种测试中心），承办国家生物安全专家委员会秘书处的日常联络工作，是全国转基因标准化技术委员会秘书处挂靠单位，全国转基因检测体系和机构能力建设、检测监测--农业部转基因生物安全监督检验测试中心等。基因安全管理处，负责生物安全评价等具体技术工作，承办两个秘书处及生物安全网的具体事务。农业转基因生物安全检定处，负责转基因检测体系及机构能力建设、检测标准、全国性监测的具体技术工作。技术支撑机构技术标准转基因产品检测技术全球主要国家转基因产品标识管理情况如何进行转基因产品的检测？

染色体水平

转录组水平

蛋白组水平

代谢组水平GM——Non-GM？转基因产品检测一般流程提取核酸或蛋白质核酸检测蛋白质检测或定性PCR定量PCR芯片检测核酸测序侧向流动试纸条酶联免疫吸附转基因生物检测基于蛋白的转基因检测方法1.酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。最常见的检测方法是夹心法。将样品提取液加入包被有目标蛋白抗体的微孔板中，转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合。加入用酶（辣根过氧化物酶）标记的目标蛋白抗体，抗原抗体产生特异性结合。洗涤以后，加入底物显色。辣根过氧化物酶催化底物成有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量分析。ELISA检测基本原理标记有蛋白抗体的酶标板根据转基因标准物质绘制的标准曲线根据外源蛋白标准绘制的标准曲线××××根据抗原抗体特异性结合的原理工作。2、侧向流动型免疫试纸条方法原理快速检测试纸条法应用了双抗体夹心法，首先将CP4EPSPS（抗草甘膦）蛋白特异的抗体，偶连于显色试剂，并参入试纸条。当试纸条被插入含有CP4EPSPS蛋白的植物组织的小量萃取物时，偶连抗体与蛋白之间就发生了结合，与偶连于显色试剂上的某些但不是全部抗体形成夹心物。膜片含有两个捕获区，一个捕获区可捕获结合的CP4EPSPS蛋白，另一个捕获区可捕获显色试剂。当夹心物和未反应的显色试剂被膜片上的特定区捕获时，这些捕获区就显现出红色。若膜片上仅存在一条红色对照线，便说明受检样品为阴性样品，若存在两条线，便说明受检样品为阳性样品。蛋白检测试剂盒蛋白检测特点ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，5～10分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。基于核酸的转基因检测方法35SpromoterEPSPSCP4NOSterminatorCaMVAgrobacteriumtumefaciens检测主要依据是目的DNA链与特定的生物大分子结合或者与特异序列的杂交目的DNA主要由具有特定功能的基因及其相应的调控元件组成。核酸检测方法策略启动子基因内含子终止子筛选检测基因特异性检测构建特异性检测转化体特异性检测低植物基因组高ArneHAetal.,EuroFoodResTech,2007植物基因组TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA模板+引物

+

三磷酸脱氧核苷酸+

Taq

DNA聚合酶+

PCR反应缓冲液（盐离子）定性PCR检测方法原理TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:变性94°C

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:退火T°依赖于引物

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGATGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA量加倍TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA定性PCR产物电泳检测DNA分子量大小对照检测产物定性PCR检测关键因子引物——设计PCR引物时使用辅助软件既可节省时间，也能避免犯错误。如Oligo、PrimerExpress、PrimerPrimier5.0、VectorNTIsuite9和PrimerSelect(DNASTARINC)等专业的引物设计软件。——引物的碱基组成、长度及靶序列的特异性是决定PCR成败的关键。——引物是指DNA聚合酶启动DNA合成时必需的一段寡核苷酸，是PCR特异性反应的关键因素，PCR反应产物的特异性是由一对上下游引物所决定的。dNTPs是PCR反应过程中DNA合成的原材料。一般反应中每种dNTP的终浓度为20～200mol/L。三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）dNTP浓度过高，碱基的错误掺入率增加，低浓度的dNTP可提高特异扩增的精确性。

反应体系中4种dNTPs的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶最早是从一种嗜热水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分离纯化获得的，后来在嗜热脂肪芽孢杆菌及其它几种耐热菌中也分离提纯到此类DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶

酶量过多会使非特异性扩增产物增加，过少则使产量降低。反应缓冲液

反应缓冲液一般含有10～50mmol/LTris·Cl，50mmol/LKCl和适当浓度Mg2+(一般为1.5mmol/LMgCl2)。Mg2+浓度既影响酶的活性和真实性，又影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体形成等，因此，合适的Mg2+浓度是PCR的关键。

必要时在反应缓冲液中还可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100g/ml的牛血清蛋白（BSA），以稳定Taq酶的活性。50mmol/L的KCl有利于引物退火，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。转基因产品定性PCR检测方法关键方法特异性9种转基因玉米检测方法的特异性示意图(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米内标准基因zSSIIb基因。泳道1～14分别是：空白对照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、MON810玉米、非转基因玉米、转基因大豆GTS40-3-2、转基因油菜RT73和转基因MON531棉花；泳道M为DL2000DNA分子量Marker.方法检测极限（LOD）相对LOD值，指的是能够检测到的最低转基因植物产品的含量，一般是以“xx%”表示的；以一系列不同转基因含量的标准DNA样品为PCR扩增模板，经过至少三次重复后，确定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低转基因含量为相对LOD值。

绝对LOD值，指的是能够检测的最低转基因植物DNA的质量，一般是以“xxpg”或“xx拷贝”表示的。以纯的基因组DNA为标准样品，以不同浓度梯度DNA样品为PCR模板扩增，经过至少三次重复后，确定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低DNA质量为绝对LOD值。已有转基因产品定性PCR检测方法

基因特异性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等

筛选特异性：CaMV35s启动子、NOS启动子和终止子、FMV35s等

构建特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系

转化体特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系上述方法LOD都达到0.1％，且很多已经标准化成为ISO和我国国家标准！！！荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。定量PCR检测方法荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。

闭管反应

(lowcontaminationrisk)

无需PCR后操作

(nogels,filmsetc)自动化高通量

单一反应管检测可以同时分析多个反应管定量PCR检测方法特点

盖子PCR管加热板

样品透镜荧光域值（threshold）以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.荧光信号PCR循环

(高浓度)高CT

(低浓度)real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC)终点（不能定量）阈值低CTCt值循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；Ct值取决于阈值；Ct值与模板DNA的起始拷贝成反比，与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系；两个重要概念定量PCR检测方法×实时荧光定量PCR方法绝对定量法，测样品中的转指的是利用定量PCR反应及其构建的标准曲线，获得检基因植物基因组或外源目的基因的质量或拷贝数。

转基因产品的定量PCR检测，主要可以分为两种方法：一种是绝对定量法，另一种是相对定量法。相对定量法，是指利用定量PCR反应和构建的标准曲线，分析获得检测样品中转基因植物基因组或外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量，结果可以用转基因基因组DNA和样品基因组DNA的质量比或者转基因植物和样品的质量比表示。108106102104T绝对定量法外源基因标准曲线内标准基因标准曲线＊获得的是样品中的植物基因组DNA或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。

绝对定量法

基因植物（外源基因）基因组质量或拷贝数×100样品转基因含量（%）＝植物（内标准基因）基因组质量或拷贝数相对定量法内标准基因外源基因ΔCT(ΔCT=参照基因的CT–转基因的CT值）VS

转基因含量之间的标准曲线定量PCR方法的关键参数特异性Specificity灵敏度Sensitivity准确度Accuracy重复性Repeatability重演性Reproducibility特异性与灵敏度只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号!需要测试不同植物品种需要测试不同的转基因植物足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求检测极限（LOD）定量极限（LOQ）定量PCR方法可接受和应用基本要求荧光染料：

SYBRGreenI、EvaGreen

引物特异性探针：

Amplifluor(Intergen)Scorpions探针通用模板探针（AUDP,UT）

LUX（LightUponExtension）探针序列特异性探针：荧光能量共振转移探针（FRET)

双标探针（TaqMan、TaqManMGB、LNA、Allglo）分子信标（MolecularBeacons，MB)实时荧光定量PCR荧光探针类型和基本原理5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI原理荧光染料法5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission优点：（1）高度的通用性，几乎可以用于任何型号的定量PCR仪和任何目标DNA序列的扩增。（2）无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低。（3）PCR反应后可以进行融解曲线分析，分析反应的特异性和目标序列的突变等。缺点：（1）不具备目标序列特异性，不能用于MultiplexPCR反应，容易受污染物，非特异性扩增产物和引物二聚体的干扰。（2）定量的准确性不高，重复性不强。（3）高浓度的染料会抑制PCR反应。Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量转移探针（FRETProbe）序列特异型探针优点：（1）为杂交型探针，自身不被降解，其荧光信号是可逆的，PCR反应后可以进行融解曲线分析，突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。（2）包含两条探针，具备很高的目标序列特异性，不受引物二聚体和非特异扩增的影响。缺点：由于需要合成两条探针，探针的末端要封闭以避免延伸反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针（TaqManProbe）优点：（1）具备目标序列特异性，良好的稳定性和灵敏度。（2）有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测MultiplexPCR，降低成本也提高效率和准确性。（3）探针自身对PCR反应的影响较小，定量的准确性高。

TaqMan是应用最广泛，最成熟的荧光定量技术，广泛的应用于人类传染病诊断、动物疾病检测以及转基因作物定量检测等。缺点：（1）探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高。

(2)探针较长使得两端基团距离较远，导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，本底信号偏高，信噪比不高。（3）其为水解型探针，反应中探针会水解，荧光信号不可逆，不能用于融解曲线分析。TaqManMGB

针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针,即TaqManMGB，其工作原理与TaqMan探针相同。TaqManMGB优点（1）3‘端采用了非荧光性的淬灭基因。（2）MGB探针的3‘端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值，提高探针的特异性。（3）探针可以设计得更短，荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。

（4）MGB探针对于等位基因的区分比较理想，可以检测单碱基突变。现在它也是转基因作物定量检测中的一种常用的定量技术。RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信标（MolecularBeaconProbe）序列特异型探针缺点:(1)杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。(2)探针合成时标记较复杂。

分子信标是转基因定量检测的常用的技术，它还可以用于突变检测，SNP检测，在其基础上发展的技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等。目前常用的序列特异性探针比较完成验证方法44个，正在进行中31个！5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR2.3.1Amplifluor引物特异性探针优点：1它是引物特异性探针，不需要引物以外的探针，节约成本，反应体系优化更加方便。2它是积累性荧光，信号不可逆，可用于融解曲线分析。3其探针序列是通用的，可用于检测任何目标序列，更节约成本。缺点：（1）对引物的扩增效率影响比较大，影响定量的准确性。（2）其稳定性不太好，其茎环结构对其标记染料的淬灭能力有限，容易出现淬灭不彻底，导致本底信号强。该技术是在分子信标的基础上发展而来的技术，具了分析信标的一般特点。通过优化各个引物对之间的浓度比，达到同时特异性扩增的目的。同时扩增8种转基因玉米的多重PCR——Harik.etal,2008转基因产品检测新技术和趋势复合PCR检测技术检测LOD可以达到0.25%，这种方法快速，灵敏，高特异性，价格低廉，方便操作，可用于日常转基因产品的检测。Harik.etal,2008什么是基因芯片技术？简单的概括就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。基因芯片的基本原理？基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知的核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片检测技术基因芯片发展历史Southern&Northern杂交斑点杂交微芯片Microarray芯片探针的设计第一部分品系特异性芯片-针对品系特异性的探针第二部分物种特异性芯片-针对内标基因的探针第三部分筛选特异性芯片-针对筛选元件的探针第四部分对照探针(i)提取样品：裂解细胞，提取DNA（或者RNA）并纯化。(iii)杂交和冲洗：按碱基配对原理DNA/cDNA样品与芯片探针进行杂交，然后对芯片进行清洗。非特异性的结合可以部分的冲洗掉。(iv)扫描和成像：用适当的方法使标记底物激发荧光或者显色，扫描仪器记录每个样点的信号值，样点信号的强度取决于杂交的样品DNA/cDNA的量。(v)数据处理与分析。读取芯片样点的信号值，对信号进行标准化等处理，通过计算机分析得出结果。工作流程(ii)样品的扩增与标记：样品DNA/RNA通过PCR扩增、反转录等技术扩增并掺入荧光标记分子或放射性同位素。Notomi,T.,H

etal.,2000,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.28:e63.引物设计原理核酸等温扩增技术循环扩增2、反应混合物加入SYBRGreenI1、反应产物凝胶电泳图LAMP产物检测表面等离子共振式传感器(Opticalbiosensors)

原理：当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时，可引起金属自由电子的共振，使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。

将目标DNA和固定在传感器表面的探针杂交，使得溶液表面的折射率改变，该折射率的改变和杂交的目标DNA的质量成正比。传感器检测技术优点：灵敏度高无需标记实时监测近红外光谱法就是一种可以同时对农产品中所有有效成分进行一次性系统分析的研究方法。近红外光谱主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，记录的主要是含氢基团Ｘ－Ｈ（Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ）振动的倍频和合频吸收，适合用于碳氢有机物质的组成与性质测量。其工作原理是，样品的组成相同，其光谱也相同，反之亦然。如果建立了光谱与待测参数之间的对应关系（称为分析模型），则只要测得样品的光谱，通过光谱和上述对应关系，就能很快得到所需要的质量参数数据。近红外光谱法（NIR）转基因检测技发展趋势

定量检测技术为转基因产品的主要检测技术

转化事件特异性检测为转基因产品检测趋势

简单、快速、现场、高通量检测方法

多种检测技术的联合使用GMODetectionMethodDatabase(GMDD)－－NucleicAcid-basedMethodsListProtein-basedMethodsList核酸DNA提取主要包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。基本原则分离纯化核酸总的原则——保证核酸一级结构的完整性；——排除其它分子对于提取和纯化的DNA的污染。核酸的纯化三点要求

核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；核酸制备的步骤多聚糖、酚复合物、蛋白质和其它细胞溶解物破碎细胞或包膜－核酸游离在裂解体系中沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。裂解抽提沉淀机械破坏

（如：碾磨、超声波处理、低渗裂解）化学处理法

（如：去污剂裂解、离液剂处理、硫醇还原等）酶消化（溶菌酶、纤维素酶等）裂解核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。通常使用苯酚和氯仿的混合物常用来除去多聚糖、酚复合物、蛋白质和其它细胞溶解物。酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。最后用氯仿抽提是为了去除核酸溶液中的痕量酚。抽提沉淀常用醇来沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质。核酸是多聚阴离子的水溶液化合物，常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇等。乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。CompanyLogoDNA提取方法DNA提取的方法BECDACTAB法SDS法聚乙烯吡咯烷酮法其它亲和诱捕核酸纯化方法核酸质量评估与定量荧光定量测定法紫外分光光吸收法琼脂糖凝胶电泳检测法SGSGMO检测报告解读35S启动子：位于外源目标基因的起点控制区NOS终止子：位于外源目标基因的终点控制区这两种筛选测试已经能够覆盖市场上大部分的转基因植物，测试中的任何一个阳性结果可能反映基因改造成分的存在。在以上两种测试中发现呈阳性结果的样品，需要通过以下两个测试，验证是否存在其它的外源目标基因。RoundupReady：抗除草剂草甘膦的基因（一种极普通的外源目标基因）Bt内毒素：抗虫的基因（一种极普通的外源目标基因）阴性对照：在进PCR时以水代替样品DNA做模板，判断样品在实验过程中是否存在污染。阳性对照：以阳性样品的DNA作模板，用作样本分析时指示PCR产物的位置。检测限对照：选用来自国际标准署（IRMM）的转基因标样，如果PCR反应信号超过或等于0.1％标准值，即指示样本呈阳性结果。内对照：几乎每一物种都含有自己特定的遗传物质，如果无法在样品中检测该种遗传物质，即认为没有可检测的DNA，或者DNA已经降解，并不适宜用作转基因成分测试。对于不知道样品材料来源的部分的样品，我们会使用几乎所用真核生物细胞中都含有的一种特定遗传物质作内对照。SGSGMO检测报告解析SGSGMO检测报告解析35S启动子NOS终止子CP4-EPSPSBt基因：35S启动子：花椰菜花叶病毒的启动子，是一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中，对它进行改造的许多启动子可以有效提高外源基因的表达水平。同时对该启动子的一些元件进行串联，也可以有效提高外源基因的表达水平。转基因产品检测，一般检测CaMV35S启动子是一段长195bp的碱基序列。

GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGT