质粒抽提及检测通则-编制说明

国家标准《质粒抽提及检测通则》（送审稿）编制说明《质粒抽提及检测通则》标准起草组2019年7月1目录（一）工作简况.............................................................................................................................41、任务来源...........................................................................................................................42、目的和意义.......................................................................................................................43、协作单位...........................................................................................................................44、标准编制过程和主要工作过程.......................................................................................45、国家标准主要起草人及其所做的工作...........................................................................6（二）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容的论据.....................................................61、标准编制原则...................................................................................................................62、确定国家标准主要内容的论据.....................................................................................62.1外观及性状..............................................................................................................62.2质粒超螺旋含量测定..............................................................................................62.2.1琼脂糖凝胶电泳法........................................................................................62.2.2HPLC法...........................................................................................................72.3质粒大小鉴定..........................................................................................................82.3.1试验方法.......................................................................................................82.3.2测定结果.......................................................................................................82.4质粒序列鉴定..........................................................................................................92.4.1试验方法.......................................................................................................92.4.2测定结果.......................................................................................................92.5质粒纯度鉴定..........................................................................................................92.5.1内毒素含量鉴定...........................................................................................92.5.2RNA污染鉴定..............................................................................................102.5.3基因组污染鉴定.........................................................................................122.5.4蛋白质污染鉴定.........................................................................................132.5.5微生物污染鉴定.........................................................................................14（三）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果...........141实验材料及仪器...............................................................................................................141.1试剂........................................................................................................................1421.2溶液 151.3仪器 152实验方法 162.1指标的建立 162.2关键指标的测定 16质粒抽提方法及流程 16、质粒测定 194.方法验证 245、经济与社会效益 24（四）采用国际标准和国外先进标准的程度， 以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况 25（五）与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系 25（六）重大分歧意见的处理经过和依据 25（七）国家标准作为强制性国家标准或推荐性国家标准的建议 25（八）贯彻国家标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容） 25（九）废止现行有关标准的建议 25（十）其他应予说明的事项 253（一）工作简况1、任务来源本标准根据国标委公布的 2018年第 四 批国家标准计划项目（国标委综合号），本项目计划编号为 20184475-T-469 ，名称为 质粒抽提及检测通则 。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（ SAC/TC387）提出并归口。本标准由 中国测试技术研究院生物研究所、 通用生物系统（安徽）有限公司等联合起草。2、目的和意义肿瘤免疫疗法给肿瘤的有效控制带来了迅速的进展，免疫疗法也入选《科学》最值得关注的6大科学领域，其中CAR-T细胞疗法所带来的临床收益是最值得肯定的。CAR-T疗法（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法），其基本原理是对人体的T细胞进行基因识别和体外基因合成改造，使其拥有超强的识别力和杀伤力，然后在不伤害健康细胞的情况下，消灭肿瘤细胞。目前，诺华（Norvatis）以CD19为靶点的CAR-T疗法药物CTL019已经获得了美国FDA颁发的优先评审资格、突破性疗法认定，治疗儿童或年轻人中复发或难治性的急性B细胞型淋巴性白血病。在国内，CAR-T的临床试验领先的是中国人民解放军总医院（301医院），使得中国研发团队跻身于全球CAR-T细胞技术转化医学研究领域的前列。据粗略估算，该疗法衍生的新药开发领域的市场容量可以高达百亿甚至千亿美金的规模。在CAR-T细胞的生产和治疗中，质粒是必不可少的，如果不能规范质粒抽提及测定，将会延缓CAR-T药物开发速度，并造成非常大的资源浪费。根据市场的要求，制定出符合 CAR-T疗法的质粒要求，为肿瘤治疗的研发推广保驾护航。目前全球范围内尚无针对这种技术的规范性文件，国内该产业正处于起步阶段，行业规范急需解决。3、协作单位4、标准编制过程和主要工作过程4.1项目预研（1）2018 年1月至 2018年3月，标准起草单位组织相关技术人员对《质粒抽提及检测通则》标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国内外 100余篇标准、文4献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排。（2）2018年9月标准起草单位向全国生化检测标准化技术委员会提交了项目建议书以及国家标准草案。（3）2018年9月，起草小组对全国生化检测标准化技术委员会汇报了《质粒抽提及检测通则》标准的起草工作，与会专家就《质粒抽提及检测通则》标准（草案）进行了讨论，提出了宝贵的意见和建议。标准起草小组根据专家意见进行了修改和完善。4.2项目立项研制（4）2019年1月收到全国生化检测标准化技术委员会生检标〔2019〕1号文件《关于下达2018年第四批国家标准制修订计划的通知》以及该标委会转发的国标委发函〔2018〕83号《国家标准委关于下达2018年第四批国家标准制修订计划的通知》立项文件，计划编号：20184475-T-469。（5）2018年9月至2019年5月，进行《质粒抽提及检测通则》标准的起草研制工作。完成了《质粒抽提及检测通则》标准的编制说明，并对全国生化检测标准化技术委员会汇报了《质粒抽提及检测通则》标准（草案）进一步完善和修改情况，向全国生化检测标准化技术委员会提交了《质粒抽提及检测通则》标准（征求意见稿）和编制说明。4.3项目征求意见2019年7月4日，全国生化检测标准化技术委员会就《质粒抽提及检测通则》标准向全体委员专家（44位专家）征求意见。共收集44位委员专家回函，其中收到10份有意见或建议的单位回函。起草小组已按照专家意见建议进行修改完善。详见“国家标准反馈意见汇总表—《质粒抽提及检测通则》标准征求意见稿。”2019年7月8日，就《质粒抽提及检测通则》标准（征求意见稿）向行业相关专家征求意见。与会专家提出了宝贵意见建议，起草单位已按照专家的意见建议进行修改完善。(8) 年 月至 月，标准起草小组根据专家意见，对《质粒抽提及检测通则》标准（征求意见稿）进行修改和完善，形成送审稿，报全国生化检测标准化技术委员会行审定。年月日至月日，全国生化检测标准化技术委员会就《质粒抽提及检测通则》标准送审稿组织函审。本TC全体委员人数为 44人，参与投票44人，投票同意本标准通过审查 42人，达到3/4通过。全体委员中，有 人为起草组成员。5(10) 年 月 日至 月 日，标准起草组针对函审专家提出的意见建议进行了汇总整理，主要是单位、格式等一般编辑性的建议，已按专家意见建议修改。有几条技术性意见修改情况如下：1,统筹考虑目前抽提和检测不同方法的共性并体现先进性;2,需要增加质粒的浓度和纯度检测，并有相应的检测方法和指标;3,质粒纯度检测可采用精度更高，操作更为方便的方法，如HPLC;4,标准中不能出现适量、足够、可能、少许等模棱两可的词汇，左右的描述都需要科学量化。(11) 年 月 日， 会后起草小组对标准文本进行了进一步修改和完善。形成了报批稿。报全国生化检测标准化技术委员会。5、国家标准主要起草人及其所做的工作（1）、本标准主要起草人：（二）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容的论据1、标准编制原则本标准的起草是在对国内外资料分析、 研究及整理的基础上，并按照标准的制定及《国家标准管理办法》的程序与基本要求进行。本编制说明按 GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》参照GB/T20001.4-2015《标准编写与规则第四部分：化学分析方法》。2、确定国家标准主要内容的论据2.1外观及性状将样品加水或TE稀释的质粒溶液，目测外观应为无色无味的透明溶液，溶液中不含固体颗粒及其他机械杂质。2.2质粒超螺旋含量测定琼脂糖凝胶电泳法试验方法采用琼脂糖凝胶电泳法对质粒的超螺旋形态进行鉴定，是实际生产中最为普遍的6方法。通过观察胶图发现，点样质粒带，通常是2-3条（意即质粒的三种形态，线性、开环、超螺旋），至上而下分别为线性（不经常出现）、开环、超螺旋，通过比对这几种质粒条带的亮度来判断超螺旋的含量。具体试验方法参见（（三）（1））。如下图实例所示：测定结果合格的质粒要求超螺旋形态的含量 ≥80%法试验方法具体方法参见（（三）（5））。质粒超螺旋含量计算方法（1）质粒纯度的计算（如下图实例所示）：质粒纯度以PPi计，数值以（%）含量表示，按式（2）计算：PPi=Ai/At ×100⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（2）式中：PPi-------试样质粒纯度；Ai--------试样峰面积；At--------总峰面积。7测定结果要求通过计算，算得的超螺旋形态质粒的峰面积比值≥ 80%2.3质粒大小鉴定试验方法通常采用限制性酶切法对质粒大小进行鉴定，结合琼脂糖凝胶电泳同时借助标准大小Marker，能够准确的判断质粒的大小。具体试验方法参见（（三）（4））。如下图实例所示：测定结果合格的质粒要求酶切结果中，酶切产物条带，上带要亮于下带且所有条带大小的加和等于质粒的大小。另超螺旋的质粒带大小通常小于质粒的实际大小。82.4质粒序列鉴定试验方法Sanger测序法是准确确认质粒每一个碱基通用方法，通过该方法，能够对质粒中每一个A、G、C、T进行精准定位，甚至可以通过测全质粒，精确知晓质粒的大小到个位数。具体试验方法参见（（三）（3））。如下图实例所示：测定结果将Sanger测序法得到的结果与相应的软件结合，判断质粒的实际序列与理论序列是否完全匹配。要求质粒的实际测序结果须与理论序列完全匹配，且测序的峰图中单个碱基的峰型要尖锐且唯一。2.5质粒纯度鉴定质粒纯度鉴定是质粒在成功交付之前非常重要的质量QC环节。质粒纯度鉴定通常包括如下几个要素鉴定，分别是内毒素含量、RNA污染、基因组污染、蛋白质污染以及微生物污染鉴定5个方面。不管其中哪一个要素的不合格，都将对交付质粒的后续实验环节产生影响。内毒素含量鉴定试验方法参见GB/T14233.2-93测定结果按不同试验要求，对内毒素含量要求不一，通常分为以下三个等级：X＞50EU950EU≥X＞5EU5EU≥X＞0EU污染鉴定琼脂糖凝胶电泳法试验方法具体方法参见（（三）（1））。测定结果通常要求质粒中不能含有肉眼可见的 RNA污染条带。 HPLC法试验方法具体方法参见（（三）（5））。含量计算RNA含量计算方法与质粒超螺旋含量计算方法相同。测定结果测得的RNA含量要求应小于1%。实时荧光PCR法检测RNA残留试验方法具体方法参见（（三）（8））。绘制曲线（实例）通过5组标准品质粒DNA的溶解曲线，可检测出特异性的峰值，且无特异性扩增的杂峰和引物二聚体的小峰，说明引物适合下面 qpcr实验。从扩增曲线看出，当质粒DNA的浓度高时CT值大，且从左到右浓度减小 CT值增大。通过数值计算出标10准品的浓度与循环阈值（ CT值）得线性曲线表达式：Ct=-2.1578LogC＋15.271溶解曲线图Real-timePCR扩增曲线11qPCR检测标准曲线测定结果要求测得的RNA含量应不高于10pg/ul。基因组污染鉴定琼脂糖凝胶电泳法试验方法具体方法参见（（三）（1））。如下图所示：测定结果要求点样胶图中，基因组条带不可见实时荧光PCR法检测基因组残留试验方法具体方法参见（（三）（8））。测定结果12测得的基因组残留不应高于 10pg/ul。蛋白质污染鉴定紫外光谱法试验方法采用紫外光谱法主要用于测量质粒浓度， 其中关于A260/280的比值通常用于初步判断质粒中蛋白质的污染情况。同样该方法也同样可以检测质粒中 RNA的污染情况和盐离子杂质等的污染情况。具体方法参见（ （三）（2））。如下表实例所示：Sample#ng/ulA260A280A260/280A260/2301308.696.1743.2251.912.222291.035.8213.0761.892.183357.857.1573.7681.92.164349.966.9993.6651.912.185285.265.7053.0061.92.1962995.983.1751.882.127395.977.9194.0781.942.238293.755.8753.0681.912.239278.225.5642.9291.92.1810239.264.7852.5151.92.1411296.425.9283.0561.942.212328.686.5743.3961.942.213304.326.0863.1131.962.2214197.483.952.0211.952.215211.44.2282.1951.932.1916271.345.4272.7861.952.2217228.944.5792.3991.912.1818218.624.3722.2771.922.1819233.464.6692.3991.952.1820300.726.0143.1671.92.18测定结果测得的A260/280的比值要求在1.8-2.0之间，高于2.0则有RNA污染，低于1.8则13为蛋白质污染。同样A2608/230应当高于2.0，低于2.0则盐离子杂质等污染。法试验方法参见GB/T19495.8-2004测定结果测得结果蛋白质污染应不高于 0.1%。微生物污染鉴定试验方法参见GB4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数和GB4789.15-2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数测定结果测得结果要求，在单位面积内，大肠杆菌的数量不能超过 1个，霉菌和酵母的数量不能超过1个。（三）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果实验材料及仪器1.1 试剂葡萄糖（glucose，C?H??O?）三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM，Tris,C4H11NO3)盐酸（hydrochloricacid，HCI）4. 乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodium salt， Na2EDTA，C10H14N2Na2O8)核糖核酸酶A（RnaseA）氢氧化钠（Sodiumhydroxide，NaOH）7. 十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecyls μ，lfateSDS，C12H25SO4Na）醋酸钾（potassiumacetate，CH3COOK）冰醋酸（AceticAcid，CH3COOH）14盐酸胍（GuanidineHydrochloride，Gu-HCI，CH6ClN3）乙醇（ethanol，C?H?O）异丙醇（Isopropanol，C3H8O）2ml离心管1.5ml离心管二氧化硅质粒吸附柱RNaseA（10mg/ml）1.2 溶液溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，100μg/mlRnase溶液Ⅱ：200mMNaOH，1%SDS溶液Ⅲ（pH4.2）：4M盐酸胍，0.5M醋酸钾。BufferW1:20mMTris-Cl,5mmol/L盐酸胍，15%异丙醇。BufferW2：20mMTris-Cl,75%乙醇。TE（pH8.0）：10mMTris-Cl，1mMEDTA。80%乙醇灭菌水1.3 仪器摇床（工作范围15℃-42℃）涡旋混合仪水浴锅（工作范围20℃-90℃）高效液相色谱（HPLC）设备一代测序仪超微量分光光度计电泳仪凝胶成像系统3730型测序仪PCR仪离心机（可在4°C下进行离心，离心转速达12000r/min以上）15金属浴实验方法2.1指标的建立本标准的起草单位经过反复讨论，对能体现质粒抽提及鉴定的技术参数及表征方法进行了确定。质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的 DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒抽提是去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。所以质粒抽提及测定主要体现在质粒纯度（A260/280，残余RNA，基因组DNA，内毒素，细菌计数），构型（超螺旋程度），正确性（限制性酶分析）。质粒抽提方法统计如下:硅胶柱法磁珠法酚仿提取及异丙醇沉淀法离子交换法质粒检测方法统计如下：琼脂糖凝胶电泳法紫外光谱法Sanger测序法限制性酶切法HPLC法样品细菌检测法BCA法实时荧光PCR法2.2 关键指标的测定质粒抽提方法及流程（1）硅胶柱法16收集2-4mL菌液到2ml离心管中，12000rpm/min，离心1min。②弃上清，尽可能干燥。③向离心管中加入250μl溶液Ⅰ（加入RNaseA），涡旋震荡使得细胞重新悬浮④向离心管中加入250μl溶液Ⅱ（裂解Buffer），温和翻转离心管6-10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清浓稠。向离心管中加入350μl溶液Ⅲ，温和翻转离心管6-10次，此时可观察到管内出现白色絮状沉淀，12000rpm室温离心10min⋯⑥将离心后上清移至二氧化硅吸附柱中，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。吸附柱中加入500μlBufferW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。向吸附柱中加入600μlBufferW2（加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液向吸附柱中再次加入600μlBufferW2（加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液⑩将吸附柱和收集管放回离心机中，12000rpm空转离心2min。将吸附柱移至新的1.5mLEP管中，向吸附柱中央的膜加40-50μl预热灭菌水，静置3-5min，12000rpm离心2min，洗脱得到液体质粒DNA。（2）磁珠法收集2-4mL菌液到2ml离心管中，12000rpm/min，离心1min。弃上清，尽可能干燥。向离心管中加入250μ溶l液1（加入RNaseA），涡旋震荡使得细胞重新悬浮。向离心管中加入250μ溶l液2，温和翻转离心管6-10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清浓稠。向离心管中加入350μ溶l液3，温和翻转离心管6-10次，此时可观察到管内出现白色絮状沉淀，12000rpm室温离心10min。上清加入新的1.5ml离心管，再加入15μl的磁珠悬浮液，震荡混匀，放置5分钟，（如需高产量，可放置10分钟）期间混匀几次。把离心管放到磁力架上，静置30sec，磁珠自动被吸附在管壁，吸弃上清，磁珠分离要在磁力架上完成。20 加入500μlBufferW2，颠倒混匀，放到磁力架上，静置 30秒，吸弃上清，磁珠分17离要在磁力架上完成。21 再次加入500μlBufferW2，颠倒混匀，放到磁力架上，静置 30秒，吸弃上清，磁珠分离要在磁力架上完成。室温放置5分钟，确保乙醇挥发干净，加50μl洗脱液，轻轻吹打使磁珠完全悬浮于洗脱液后，于室温静置1分钟。把离心管放到磁力架上，静置30sec，磁珠自动被吸附在管壁，将洗脱液转移到洁净的离心管中，-20℃中保存备用。（3）酚仿提取及异丙醇沉淀法收集2-4mL菌液到2ml离心管中，12000rpm/min，离心1min。弃上清，尽可能干燥。向离心管中加入250μ溶l液1（加入RNaseA），涡旋震荡使得细胞重新悬浮。向离心管中加入250μ溶l液2，温和翻转离心管6-10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清浓稠。向离心管中加入350μ溶l液3，温和翻转离心管6-10次，此时可观察到管内出现白色絮状沉淀，12000rpm室温离心10min。取上清中于新的EP管中，并记录体积。加等体积的苯酚/氯仿溶液，振荡充分混匀，12000rpm离心10min。上清液中于新的EP管中。小心吸取上清液中于新的EP管中，再次加等体积的苯酚/氯仿溶液，振荡充分混匀，12000rpm离心10min。小心吸取上清液中于新的EP管中，加等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心10min。小心弃去上清。加入1ml75%乙醇清洗沉淀，12000rpm1min，弃去上清。36 于超净工作台开风将残留乙醇吹干，加 50-100μlddH2O溶解，-20℃保存。（4）离子交换法从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到4ml选择性培养基，37℃摇床培养6小时,220rpm。取上一步菌液接种到300ml选择性培养基中，37℃摇床培养16小时,220rpm。把300ml的菌液倒进500ml离心杯中，4℃离心，6000g离心10分钟。倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入30ml4℃预冷的细胞重悬液bufferP118（确定是否加了 RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。加入30ml细胞裂解液bufferP2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。加入30ml预冷的bufferP3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育10分钟。后再一次混匀样品．8000g，4℃离心20分钟在层析柱的顶端加滤纸，并且用bufferQBT润湿。用20ml的bufferQBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。然后把上一步的上清小心移到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。用20mlbufferQC清洗层析柱一次.用20mlbufferQF洗脱DNA,用50ml的离心管分别收集洗脱液。在洗脱液中各加入0.7倍体积的室温的异丙醇沉淀DNA。49 离心前一定要上下颠倒混匀，然后在 4℃,8000g离心20分钟。取出时保持管平行移动，小心的倒去上清.注意:不要将沉淀倒掉.用2ml室温的70％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀盐及置换异丙醇),4℃,8000g离心10分钟。取出时保持管平行移动，小心倒掉上清.注意:不要将沉淀倒掉。在空气中干燥沉淀5-10分钟,用合适体积的TE（一般500μl）溶解沉淀。、质粒测定1）琼脂糖凝胶电泳法称取需要量的琼脂糖于烧瓶中，取适量的电泳缓冲液加入烧瓶，在微波炉中融化琼脂糖，旋转使之均匀混合。②待琼脂糖冷却至55℃时，加入荧光染料溴化乙啶，倒入插有样孔梳的凝胶灌制平板上，去除气泡。③待琼脂糖凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，并使样品孔位于电场阴极。④在电泳槽中加入足量的电泳缓冲液，盖住凝胶并超过胶高1mm。⑤将所制备的质粒样品加上加样缓冲液（LoadingBuffer）后混匀，总量不能超过凝胶孔的容积，并加入适量的相对分子质量标志物Marker。⑥连接导线，使质粒在凝胶中由阴极向阳极移动，设定电压强度，一般是191V/cm~5V/cm，开始电泳。⑦ 当加样缓冲液中的溴酚蓝染料迁移的距离足以判断质粒片段的分离时， 关闭电源，电泳结束。⑧ 将电泳结束的凝胶直接置于紫外灯下进行观察并拍照，并根据试验目的进行初步分析。2）紫外光谱法打开核酸微量定量仪。② 打开电脑桌面软件，从主菜单界面选择核酸样品检测模块 NucleicAcid。③ 在测量前，要选择样品种类，即选择 dsDNA。④ 抬起测量平台上臂，用移液器吸取 2μl纯水滴于测量平台中央，轻放测量平台上臂，点击空白对照按钮 Blank。⑤用干净的吸水纸擦去上下测量平台上残留的纯水，吸取2μl待测样品滴于测量平台中央，轻放测量平台上臂，点击样品测量按钮Measure，约1-2sec后，计算机便会计算并显示出样品测量的各种参数，读取ng/μl所显示的数值。⑥ 定量完成后，选择 Exit退出，关闭微量定量仪电源。⑦ 核酸微量定量仪会显示质粒的浓度， A260/A280，A260/A230的比值，A260/A280为1.8-1.9，A260/A2302.0的质粒DNA样品可视为较纯DNA。（3）Sanger测序法①取0.2ml的PCR管，编号，将管插到冰上，按下表配制体系。试剂体积（μl）BigDyeMix1待测质粒1测序引物1灭菌水2②反应总体积为5μl，盖紧PCR管后，瞬离。③将PCR反应管置于PCR仪上扩增，反应程序设置如下：温度 循环数98°C2min 196°C10s ，50°C5s ，60°C4min 254°C -20④ 将产物转移至新的 1.5mlEP管中。⑤ 加入 25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分混匀，置冰上 10min，沉淀 DNA。4°C,12000r/min离心5min,小心弃上清。⑥ 加入50μ75%l（v/v）洗涤沉淀2次。4°C，12000r/min离心5min，弃去上清，真空干燥10min.⑦ 加入12μl去离子甲酰胺，混匀，充分溶解 DNA，瞬离。⑧ 将溶液转移至新的 EP管中，瞬离。98°C变性5min，迅速插入冰上，静置2min。⑩上机。11数据处理（4）限制性酶切法①取0.2mlEP管，编号。按下表体系添加试剂体积（μl）质粒(100ng/μl)210×限制性酶buffer1限制性酶10.5限制性酶20.5灭菌水6总反应体积10μl。② 混匀，盖紧盖子，瞬离，置于预先设定好温度的水浴锅中，反应 10-30min。③ 取5μl酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测方法参考附录 B.1琼脂糖凝胶电泳法④ 判断质粒经酶切后的电泳条带是否符合理论大小。5）HPLC液体质粒为待测样液。② 将疏水层析柱Source15PHEcolumn连接到HPLC系统，检测波长 260nm。柱温为室温，流速1ml/min。③ 用1.5M硫酸铵、10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液平衡层析柱。④ 供试样液和平衡溶液按照 1:10混匀，作为上样液。21⑤取30μl稀释后的供试样液进样，并使用平衡液继续洗脱0.8min。⑥改用10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液继续洗脱0.7min。⑦重新使用1.5M硫酸铵、10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液洗脱5.5min。⑧收集吸光度和电导率数据。⑨计算质粒所占峰面积所占比例来计算质粒纯度。（6）样品细菌检测法参考GB4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数GB4789.15-2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数7）BCA法参考GB/T19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法8）实时荧光PCR法检测基因组gDNA残留分别配置浓度为1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1ng/μl、10ng/μl的大肠杆菌基因组DNA标准品。② 按如下体系配置 qPCR反应体系，大肠杆菌基因组 DNA标准品也按照同样方法配置反应体系和进行 qPCR反应。质粒DNA(10ng)1μl上游引物0.5μl(100-1000nmol/L)下游引物0.5μl(100-1000nmol/L)TaqDNA聚合酶0.5μlPCR反应buffer1μlDNTP0.2mMSYBRGreen核酸染料0.5μlddH2O5μl③ 按如下反应条件进行 qPCR反应预变性 94°C10min循环反应 94°C15s60°C 45s溶解曲线 95°C 15s60°C 60s95°C 15s22④根据1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1ng/μl、10ng/μl的大肠杆菌基因组DNA标准品实时荧光定量PCR的Ct值做标准曲线，根据待测样品的Ct值和标准曲线，计算质粒DNA中的基因组DNA残留量。9）实时荧光PCR法检测大肠杆菌质粒中RNA残留准备大肠杆菌细胞用于RNA提取。② 将大肠杆菌细胞吸入 EP管中，12000r/min离心1min，弃上清，加入 1mLTrizol混匀，室温裂解