第八章植物细胞培养及次生物质生产

第八章植物的细胞培养

及次生代谢产物生产培养过程：培养物外植体愈伤组织不定芽根形成愈伤组织诱导培养基再分化培养基生根培养基

植物细胞培养（PlantCellCulture）:在离体条件下，对植物单个细胞或小的细胞团进行培养和继代培养，大量获得细胞群体的技术。植物细胞培养的类型单细胞培养(单个细胞)细胞悬浮培养(小的细胞团)大规模细胞培养(大量培养细胞)第一节植物的单细胞培养一、植物细胞分离方法机械分离法：从完整植物器官和组织中分离单细胞的方法。常用的是叶片（叶肉组织排列疏松）。将叶片轻轻研碎、过滤、离心、收集、净化优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方法。优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。植物细胞分离方法愈伤悬浮法：从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团。优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离细胞或小的细胞团。植物细胞分离方法二、单细胞培养技术（singlecellculture）1、平板培养(platingculture)2、看护培养(nurseculture)3、微室培养(micro-chamberculture)4、双层滤纸培养(feederlayercultur)1、细胞平板培养将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。细胞悬浮过滤与培养基混合植板培养克隆愈伤组织平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率＝×100%

每个平板接种的细胞总数优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。2、看护培养3、微室培养细胞起始密度：30～80个/室优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。

把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。4、双层滤纸培养（饲养层培养）第二节悬浮培养细胞悬浮培养（Cellsuspensionculture)：将单个游离细胞或小细胞团悬浮于液体培养基中，在保持良好细胞分散状态下进行培养（悬浮振荡培养）的技术。一、细胞悬浮培养技术悬浮培养包括：愈伤组织的诱导;

悬浮系的建立与细胞的生长增殖(一)愈伤组织的诱导适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织要求：松散性好（疏松易碎）、增殖快。适宜的外植体：幼茎、叶柄等是最常使用的外植体适宜的培养基：适当的激素浓度；较低的蔗糖浓度；必要的附加物质多次继代筛选

外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。

适于悬浮培养适于再生植株(一)愈伤组织的诱导(二)悬浮系的建立与继代培养愈伤组织1-2g愈伤/10-20ml培养基100、250ml三角瓶（30、70ml培养基）120rpm,25℃黑暗培养,初始培养换液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养100-110rpm（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为1周时（原悬浮液：新培养基=1：4）悬浮细胞的起始密度一般在104×105个细胞/毫升成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在20～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。实例分析：P87二、悬浮培养工艺1、分批培养：培养体系（培养基、培养物）处于封闭状态，既不向培养系统中补充培养基也不从系统中排出培养物，（一次性加入培养基，一次性收获培养物）。悬浮细胞的生长动态指指2、连续培养

在培养过程中，不断排出悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

类型：（1）半连续培养

指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。（2）连续培养

封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。

开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。a.恒化培养b.恒浊培养连续培养的特点（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。（2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。（3）适于大规模工业化生产。第三节规模化细胞培养生产次级代谢产物一、代谢产物(metabolites)初级代谢产物(Primarymetabolites)：生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。次级代谢产物(Secondarymetabolites)：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、色素、生物碱、毒素等。

二、植物细胞培养生产代谢产物的意义例：紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植中分离得到的一种双萜类化合物。C47H51NO14，分子量：853.90用途：具有良好的抗癌活性，尤其对晚期、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分显著的疗效。制备途径：1.直接从红豆杉中提取；2化学全合成化学半合成；3.内生真菌培养；4.植物细胞培养。提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005%左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏宝贵资源、不可持续发展。化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率仅4-5%。成本高

二、植物细胞培养生产代谢产物的意义

利用植物细胞培养技术生产植物产品显然是工业化生产植物产品的一条有效途径三、规模化细胞培养植物细胞规模化培养过程（一）诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织,建立悬浮细胞系（二）筛选高产细胞系（细胞株，种子细胞）（三）大量培养细胞（/团）并适时采收细胞株（CellStrain)细胞系(Cellline)：经继代培养纯化，获得的以一种细胞为主的能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株(Cellstrain)：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单胞系增殖形成的、生长速度快、目标产物含量高、适宜于大规模培养的均一的细胞群体。（一）细胞株的诱导与筛选（1）分散性好，适合大规模悬浮培养；（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致；（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌；（4）目标产物含量高，容易分离提取；（5）细胞遗传稳定。

适合大规模培养的细胞株应具备何条件？1、细胞株的诱导愈伤组织的诱导与培养单细胞的分离

细胞无性系的分离

单细胞培养多次继代筛选2、细胞株的筛选与增殖培养3、筛选细胞株的增殖培养悬浮培养（摇瓶培养），逐级放大，获得大量的活跃生长的种子细胞群体；细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和变异。培养基的选择1977年Zenk提出：(1)维持培养基(maintenancemedia)

——尽可能快的使细胞量增长(2)生产培养基(productionmedia)——诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物两步培养技术P91培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。(1)诱导剂：

可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质。

无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用机理:

可以调节代谢进程某些酶的活性,并对某些关键酶在转录水平上进行调节。加入诱导剂或前体物

作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中间体的分隔和有效贮存，大大提高次生代谢物的产量。(2)前体物烟草：天仙子胺尼古丁产量降低新烟碱含量大大提高

生物反应器的选择适合植物细胞悬浮培养的生物反应器的特点：合适的氧传递；良好的流动性；较低的剪切力。生物反应器的类型及特点1、悬浮培养系统生物反应器2、固定化培养系系统生物反应器植物悬浮培养的生物反应器特点：具有合适的氧传递、良好的流动性和低的剪切力。①悬浮培养生物反应器类型机械搅拌式气动式（气升式，鼓泡式）机械搅拌式生物反应器机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计。优点：1）培养环境保持基本稳定（氧气，二氧化碳，温度，pH等）2）搅拌充分，细胞供氧和混合效果好缺点：过高的剪切力，易对植物细胞造成伤害。气升式生物反应器5L气升式植物细胞（或器官）培养罐气升循环式生物反应器内环式外环式鼓泡式生物反应器气动式生物反应器利用空气为动力，带动培养容器中的液体流动。适宜于植物细胞培养的一类生物反应器优点：剪切力小，对细胞损伤小，易长期无菌培养。缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混合效果差；此时如果提高通气量又会产生大量泡沫。悬浮培养系统的优点1）可以保证良好的混合状态，增加细胞与培养液的接触面，促进营养的吸收，获得良好的气体传递效果。2）细胞生长快，能大量提供比较均匀的细胞。3）可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放大实现规模化。细胞固定化：指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。②固定化反应器固定化培养的优点p95：易于控制培养系统的理化环境和收集产物；包埋后细胞受到的剪切力损伤减少；

细胞生长较缓慢，有利于次生代谢物的积累；有利于进行连续培养和生物转化；固定化细胞培养的条件选用固定化细胞培养应具有如下两个条件：目的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改变PH值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培养基中；要求产物的形成在细胞生长之后。产物积累与细胞生长关系

生长偶联型中间型非生长偶联型细胞固定化方法常用的包埋固定方法：（1）海藻酸盐固定化滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒（2）卡拉胶固定化滴入NaCl使卡拉胶形成颗粒（3）琼脂糖固定化（4）琼脂固定化海藻酸钙固定植物细胞的技术路线：大量培养植物细胞混合倒入塑料注射器慢慢滴入含氯化钙培养基一定浓度的海藻酸钠溶液海藻酸钙固定的细胞团

小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进行。配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，使之形成球形颗粒，然后通过过滤收集颗粒，用含有CaCl2的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。大规模植物细胞固定化装置含CaCl2的培养基盖子空气出口海藻酸钠+细胞悬浮液喷嘴无菌空气入口

大规模固定化植物细胞需要采用大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化。常见的几种植物固定化生物反应器系统①流化床生物反应器：细胞包裹在胶粒、金属或泡沫颗粒中。优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高。缺点：剪切力或碰撞破坏细胞。（b）空气出口空气进口流化床生物反应器培养基常见的几种植物固定化生物反应器系统②填充床生物反应器：细胞固定在胶粒、金属或泡沫颗粒或连续多个网中，或位于支持物表面。细胞固定不动。（a）出口进口填充床生物反应器优点：单位体积固定细胞量大缺点：混合效果低，对必要的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除的困难常见的几种植物固定化生物反应器系统附着式固定化培养系统——膜生物反应器常用中空纤维和螺线式卷绕反应器。缺点：传质效率低、易阻塞，产物收获较困难，投资大。

膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。细胞细胞营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物质a-中空纤维反应器b-螺线式卷绕反应器四、产物的分离纯化（不作要求）1、细胞破碎2、沉淀分离3、层析分离4、萃取分离5、结晶6、浓缩与干燥8、抽提

在培养体系中加入脂溶性有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物