第五章酶分子修饰

第五章酶的分子修饰Chapter5ModificationofEnzymeMoleculeContentsofchapter5第一节概述第二节酶的金属离子置换修饰第三节酶的大分子修饰第四节酶分子的侧链基团修饰GoGoGoGo第八节酶的定向进化GoGoGoGoGo第五节酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)第六节氨基酸置换修饰第七节酶分子的物理修饰第九节酶分子修饰的应用第一节概述

一、什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。二、酶分子修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰肽链有限水解修饰酶蛋白侧链基团修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰三、酶分子修饰的意义酶是一种特殊的蛋白质，有巨大的利用价值。而酶同时也存在着许多缺陷，如大多数酶对酸、碱、重金属、有机介质、高温等物理或化学环境条件异常敏感。还有些酶的活性、作用专一性和作用条件常常不能满足生产工艺的要求，这就影响了一些酶的商业用途。人们希望工业用酶能有较强的抗酸、碱、高温及耐有机溶剂的能力，希望药用酶蛋白低毒甚至无毒，具有活性高、作用时间长的特点。为了让酶满足人类需求，科学家试图改造蛋白质的结构来达到这一目的。其中一种方法是通过基因定点突变，有选择地改造蛋白质分子，20世纪80年代初，蛋白质工程应运而生；其中另一种方法是用化学试剂与酶的某些基团结合，从而改变酶的结构和催化特性，这就是酶的化学修饰技术。三、酶分子修饰的意义改变酶的作用特性。包括改变酶的活性，作用专一性，对效应物的响应等等。增强酶的稳定性。如引入一些亲水基，增强酶对介质的亲和性，使酶的稳定性得到提高。降低或消除酶的抗原性。防止酶在体内被降解或引起免疫反应。如采用分子化合物进行修饰，或采用水溶性大分子进行保护性修饰，使医药用酶与免疫系统、蛋白水解系统隔离。研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响表5-3天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶抗抑制剂抗蛋白酶修饰剂抗失活剂过氧化氢酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂——抗尿素抗SDS表5-4天然酶与修饰酶的半衰期比较酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶修饰剂半衰期天然酶修饰酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表5-5天然酶与修饰酶的最适pH酶修饰酶天然酶修饰剂糜蛋白酶猪肝尿酸酶吲哚-3-链烷羟化酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0四、酶分子修饰的基本要求和条件

对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况

活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度

pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间

严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例

回本章目录五酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。第二节酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。

c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。

经过金属离子置换后的酶，往往呈现不同的催化特性。如，一般天然α淀粉酶是杂离子型的，其中大部分含有钙离子，有些则含有镁离子、锌离子或其它金属离子。如将其它离子都换成钙离子，成为钙型α淀粉酶，研究表明：结晶钙型α淀粉酶比天然杂离子型α淀粉酶的稳定性提高3倍以上。在α淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中添加一定量的钙离子，有利于提高和稳定α淀粉酶的活力。Zn型蛋白酶的Zn2+被Ca2+置换，所得的钙型蛋白酶活性提高20％-30％，若制成结晶，酶活可提高2-3倍。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。第三节酶的大分子修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶

半衰期相对稳定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。（3）降低抗原抗体反应

（1）通过分子结合修饰可以提高酶活力：如，每分子胰凝乳蛋白酶与n分子的右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶的5.1倍：糖分子上的邻双羟基在溴化氰的作用下活化，然后在碱性条件下，与酶分子上的氨基反应而共价结合。（2）通过分子结合修饰，可以增加酶的稳定性PEG分子末端有两个可被活化的羟基，但化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG），只带一个可被活化的羟基。★酶的稳定性用酶的半衰期表示。所谓酶的半衰期是指酶的活力降低到原来活力一半时所经过的时间。例如，超氧化物歧化酶（SOD）可清除细胞外液中存在的超氧阴离子（），作为抗衰老和抑制炎症的药物，其稳定性及在体内的半衰期仅6~10min，影响了药用效果。实验证明，用聚乙二醇或右旋糖酐、聚蔗糖分别对该酶Lys(赖)上的ε—NH2进行修饰后，分子量明显增大，SOD在血液中的半衰期可以从原来的6min增加到几h，最高达到35h。（3）通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性酶蛋白大多是从微生物、植物或动物中获得的。对人体来说是一种外源蛋白质，当外源酶蛋白非经口（注射等）进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。产生的抗体可与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去其催化功能。消除抗原性公认的修饰剂是聚乙二醇（PEG）（Mr=500~20000D）聚乙二醇（PEG）是线性分子，具有较好的生物相容性。聚乙二醇在体内不残留、无毒性和抗原性，它的末端羟基经活化后可与酶反应产生交联。如，L—天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，抗原性完全消除（修饰方法同上）。L—天冬酰胺酶具有较强的抗肿瘤作用。当天冬酰胺酶注射进入人体后,人体的正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶,可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质的合成不受影响.而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说,由于本身不能合成天冬酰胺,外来的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉,(它能将肿瘤细胞生长所需的L—天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨.)因此蛋白质合成受阻,从而导致癌细胞死亡.从而特异地、有效地抑制肿瘤细胞的生长。在国内外，是治疗淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤，治疗指数最高的药物。但由于它来源于微生物，对人而言是一种外源蛋白质，有较强的免疫原性。研究表明，用聚乙二醇修饰能较好地克服这一缺陷。1994年，美国FDA正式批准该药在美国上市。商品名为Oncaspar。PEG修饰的人血红蛋白，可作为血浆代用品，冷冻干燥后可永久保存，输血与血型无关，避免输血时可能发生的肝炎或艾滋病毒感染。第四节酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。催化活性/非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。

经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。1．氨基修饰例如，天冬酰胺酶是一种抗白血病的药物，注入体内后很容易被代谢。为此，用亚硝酸修饰天冬酰胺酶N—末端Ile(异亮)的氨基与肽链中Lys(赖)的ε—氨基，脱去氨基后，变成羟基，酶活力不变，但在体内的半衰期延长2倍，疗效显著提高。用O—甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中赖氨酸残基上的氨基与它结合，将氨基屏蔽起来，修饰后，酶活力基本不变，但稳定性显著起高，而且很容易形成结晶。凡能使蛋白质侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂，主要有亚硝酸、二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯。O—甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。氨基修饰剂可以使侧链氨基发生脱氨基作用，或者与氨基共价结合将氨基屏蔽起来。2．羧基修饰常用的羧基修饰剂有：碳二亚胺、乙醇—盐酸试剂、异恶唑盐等。其中水溶性的碳二亚胺类特定的修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。3．胍基修饰蛋白质分子中精氨酸残基的侧链是胍基。采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环改变酶分子的性质和结构的方法称为胍基修饰。胍基修饰剂有：环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。巯基在维持亚基间的相互作用和酶催化过程中起重要作用，巯基具有很强的亲核性，在含有半胱氨酸的酶分子中是最容易反应的侧链基团。已经开发了许多修饰巯基的特异性修饰剂。其中Ellman试剂[DTNB,5’5’-二硫代-双（2-硝基）苯甲酸]是最常用的巯基修饰剂，可以对酶分子中巯基的数目进行定量，用于研究巯基改变程度和巯基所处的环境以及蛋白质的构象变化。4．巯基修饰[DTNB,5’5’-二硫代-双（2-硝基）苯甲酸]DTNB与巯基反应形成二硫键，释放出1个2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处有最大吸收，因此能够通过光吸收的变化跟踪反应程度。5．酚基修饰修饰酶蛋白酪氨酸残基的酚环。有硝化法，琥珀酰化法、碘化法等。四硝基甲烷（TNM）琥珀酸酐焦碳酸二乙酯（DPC）+CH3CH2OH+CO2碘代乙酸组氨酸残基位于许多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸。DPC在近中性的PH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。6．咪唑基修饰双功能试剂分子两端功能基团的反应活性，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。近年来，设计了一些对称的“双头”试剂，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间搭桥，形成多肽链内的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变，这种试剂称为双功能试剂。如戊二醛、乙二胺、二氨基丁烷等。7．分子内交联修饰第五节酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。通过主链修饰，可以知道酶活性中心在主链上的位置，了解主链不同位置对酶催化功能的贡献。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。胃蛋白酶原的激活1．主链的切断修饰主链切断后，可能出现下列3种情况：①主链切断后，酶活性中心遭到破坏、酶失活。这种修饰主要用于探测酶活性中心的位置。②主链切断后，仍可保持酶活性中心的构象，酶的催化功能可以保持不变或损失不多，同时酶的抗原性降低或消失。有些酶蛋白具有抗原性。酶的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往有较强的抗原性，而小分子蛋白或肽段的抗原性较低或无抗原性。采用适当的方法使酶分子肽链在特定的位点切断，其相对分子量减小，就有可能在基本保持酶活力的同时，使酶的抗原性降低或消失，这种修饰方法又称为“肽链的有限水解修饰”。例如：木瓜蛋白酶，用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，切除其肽链的三分之二，该酶的活力基本保持，其抗原性却大大降低；酵母的烯醇化酶有限水解，切除150个氨基酸残基的肽段后，酶活力仍然保持，抗原性却显著降低。③若主链的断裂有利于酶活性中心的形成，则在切断修饰之后，酶蛋白显示其催化功能或酶活力的提高。例如，胰蛋白酶酶原，用肠激酶或胰蛋白酶进行修饰，切除一个六肽，从而显示胰蛋白酶的催化功能。天冬氨酸酶经过胰蛋白酶修饰，从C末端切除10多个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5.5倍。这说明天然酶并不总是处于最佳构象状态。胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活2．主链连接修饰——“多酶融合体”主链连接修饰是通过基因融合技术，将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成的融合基因，再经过克隆和表达，获得各种多酶融合体。所谓多酶融合体是具有两种或两种以上催化活性的酶连接在一条肽链上，往往是基因融合的产物。它可以是单体酶，也可以是寡聚酶。例如：天冬氨酶激酶——高丝氨酸脱氢酶融合体是α4四聚体（Mr=4×86KD）。每条肽链含有两个活性区域：N-端部分的天冬氨酸激酶和C-端部分的高丝氨酸脱氢酶。这两个活性区域用蛋白酶水解切开后，分别具有两种酶的催化活性，这种一条肽链连接两种不同酶活性的酶称为“双头酶”。3．主链剪接修饰迄今，主链剪接修饰主要靠酶法。例如，人和猪的胰岛素，仅在β链C端有一个氨基酸的差别。在无色杆菌蛋白酶作用下，将猪胰岛素β链C末端的Ala(丙)水解下来，然后用同一酶将Thr(苏)接上去，即可将猪胰岛素转变成人胰岛素。丹麦的NOVO公司用两年时间，已将这项成果工业化。氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。

现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。第六节氨基酸置换修饰酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析酶修饰酶性质的改变修饰部位原氨基酸残基→新氨基酸残基酪氨酰-tRNA合成酶51ThrPro对底物ATP的亲和力提高100倍T4—溶菌酶3IleCys热稳定性提高β—内酰胺酶70→7170→71Ser·ThrThr·SerThr·SerSer·Ser完全失活恢复活性嗜菌体T4溶菌酶分子中没有二硫键，但含有二个巯基，（Cys54，Cys97），其中Cys(半胱)97靠近三级结构中的N末端，且与Ile3(异亮)很靠近，用定点突变法将Ile3突变成Cys3后，在温和条件下氧化，形成二硫键。Perry等人证明，天然酶与突变体酶的构象是一样的，催化活力相同，但由于在酶分子中引入新的二硫键，使酶的结构更牢固，突变体酶的热稳定性显著高于天然酶。第七节酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。例如，高压处理纤维素酶，该酶的最适温度有所降低，在30℃~40℃条件下，比天然酶的活力提高10%；天冬氨酸甲酰转移酶在12000Pa压力下处理以后，酶活力提高三倍。高压处理甚至可改变酶的底物专一性。羧肽酶γ经高压处理，底物专一性发生改变。其水解能力降低，而有利于催化多肽的合成反应。天冬氨酸酶经高压处理一定时间后，可以催化D—Asp的氨解反应。一般认为，蛋白质在压力的影响下，会改变它的体积、构象及活性部位。酶分子空间构象的改变，可以在某些变性剂的作用下，破坏原有的空间构象，然后在不同的物理条件下，酶分子重新构建新的空间构象。例如：胰蛋白酶用盐酸胍处理，破坏蛋白质的副键，肽链充分伸展，原有的空间构象被破坏。然后，透析除去变性剂，再在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，在20℃条件下，重新构建的胰蛋白酶与天然胰蛋白酶的稳定性基本相同；而在50℃条件下重新构建的酶，稳定性比天然酶提高5倍。

第八节酶的定向进化酶分子的合理设计(rationaldesign)酶分子的定向进化(directedevolution)酶的合理设计体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的DNA改组和外显子改组DNA改组（DNAshuffling）又称有性PCR(sexualPCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组（e