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文档简介
1实验02-1油菜籽中不饱和脂肪酸的分离
(反相纸层析法)2棕榈、大豆、油菜和向日葵是世界范围内最重要的四大油料作物。脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,其中不饱和脂肪酸又分成单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种。哺乳动物本身不能合成亚油酸(18:2
)、亚麻酸(18:3
)和花生四烯酸(20:4),必须从食物中获得,因此也称为“必须脂肪酸”。3乙酰CoA脂肪酸合成16:0逐级羧化18:0软脂酸硬脂酸18:0硬脂酸20:022:0花生酸22:1Δ13山嵛酸24:0木蜡酸芥酸18:1Δ9油酸18:2Δ9,12亚油酸18:3Δ9,12,15α—亚麻酸18:3Δ6,9,12γ—亚麻酸20:4Δ5,8,11,14廿碳烯酸(花生四烯酸,ARA)双低油菜:低芥酸和低硫甙×4一、实验目的初步掌握用纸层析法测定油菜籽中脂肪酸的组成的方法二、原理在纸层析中,通常支持相是含水的,移动相是有机溶剂。脂肪酸用有机介质为支持相,以含水溶剂为移动相,也就是所谓“反相纸层析法”。5由于不同的脂肪酸在两相中的分配系数不同,在层析滤纸上移动速率就有差异,最后使混合脂肪酸的各组分被分开。然后用醋酸铜处理,将脂肪酸转化为相应的铜盐,再用红氨酸显色,即可得到蓝灰色点状层析图谱。6蓝灰色复合物7三、材料、设备与试剂(一)实验材料:油菜籽(二)设备:1.层析纸;2.层析缸;3.层析架;4.显色盘;5.电吹风;6.微量进样器或毛细管。8(三)试剂5%KOH-CH3OH溶液2.10%液体石蜡-石油醚溶液3.95%醋酸溶液4.1%醋酸铜溶液5.0.03%红氨酸(二硫代草酰胺)溶液6.1mol/LHCl7.石油醚9四、实验步骤(一)样品制备磨样:将1克干燥的油菜种子放在研钵中研磨成粉状,倒入磨口试管中加入1mLKOH-CH3OH溶液,25℃~30℃条件下放置6~8小时(酯化)。加入1mL1mol/LHCl及1mL石油醚。10(二)点样在经石腊油处理并晾干的层析纸一端1.5~
2cm处用铅笔轻轻划一直线,每隔3cm用铅笔轻轻点一记号并编号。在层析纸各编号处,用毛细管取样品上清液0.01mL,按编号顺序滴入点样处(每个点重复点样2~
3)。11(三)展开溶剂系统与条件将点好样的层析纸固定,编号端朝下放入盛有醋酸溶液的层析缸中,醋酸溶液的多少以能浸泡层析纸但液面低于点样处为宜。至展层剂上升到距滤纸顶端2/3处为止,取出层析纸,吹干。12(四)显色将吹干的层析纸放入醋酸铜溶液中浸泡约20-30秒,使之生成脂肪酸铜盐。用清水冲洗,再放入洁净的瓷盘中,用流水漂洗20分钟以上。将层析纸小心取出,放置在洁净的吸水纸上,用电吹风吹干。将吹干的层析纸在红氨酸溶液中一带而过,层析分离后的脂肪酸立即显出蓝灰色的斑点。13五.结果分析根据纸层析色谱上的斑点位置标出5种不饱和脂肪酸。图谱中的顺序由下而上为:芥酸、廿碳烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。六、分析讨论根据结果比较不同油菜种子中芥酸含量的高低。14亚麻酸亚油酸油酸廿碳烯酸芥酸15实验02-2油菜籽中硫代葡萄糖甙总量的快速测定(葡萄糖试纸法)
硫代葡萄糖甙(简称硫甙)是广泛存在于十字花科植物中的一种含硫化合物,其结构同时如下:16
在植物体内硫代葡萄糖甙葡萄糖水解酶的作用下,会分解产生异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮、腈等剧毒物质,是影响油菜籽综合利用的重要限制因素。“双低油菜”指的就是“低芥酸、低硫甙”。快速测定油菜籽中硫代葡萄糖甙的含量,对于选育、筛选“双低”油菜具有重要意义。17一实验目的掌握快速测定油菜籽中硫甙的总量原理和方法二、实验原理十字花科植物种子种含有硫甙和分解硫甙的硫甙酶,将油料种子经破碎后,加入适量的水,硫甙酶便可促使硫甙水解,每分子的硫甙经水解后产生一分子的葡萄糖,用葡萄糖试纸便可快速检测水解液中葡萄糖的含量,根据葡萄糖与硫甙的定量关系便可知待测样品中硫甙总量的高低。18固定化酶:尿糖试纸:葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧,原子氧可以将某种无色的化合物氧化成有色的化合物,将上述两种酶和无色化合物固定在纸条上,制成测试尿糖含量的酶试纸。19三、材料、仪器设备及试剂(一)材料油菜种子(高硫甙、低硫甙品种)(二)仪器设备
1.点滴板2.玻棒3.滴管(三)试剂1.蒸馏水2.葡萄糖试纸20四、实验步骤分别取高硫苷、低硫苷油菜种子5-10粒放入点滴板中,用滴管各加入3~5滴蒸馏水,用玻棒捣碎后搅匀,将葡萄糖试纸浸入被测液中,3~
5min后,将试纸取出并与标准色阶进行比较。21五、结果分析记录不同油菜种子中试纸与标准色阶进行比较的结果。六、分析讨论根据结果,比较不同油菜种子中硫甙含量的高低。22实验03
植物组织中还原糖含量的测定
(斐林试剂比色法)23脱色的程度与溶液中还原性糖含量成正比关系。在590nm波长下比色测定吸光度,根据吸光度的减少值查标准曲线,即可计算出所测样品中还原糖的含量。一、原理植物组织中的可溶性糖可分为还原糖(主要是葡萄糖和果糖)和非还原糖(主要是蔗糖)两类。还原糖具有自由的醛基和酮基,具有还原性。在碱性、加热条件下,还原基团能把斐林试剂中CuSO4的Cu2+还原成Cu+,生成Cu2O红色沉淀,蓝色的斐林试剂溶液因失出部分Cu2+而脱色。24
材料:新鲜植物叶片
仪器设备:分光光度计、分析天平、低速离心机、水浴锅等
试剂:
1.斐林试剂A液:40gCuSO4·5H2O溶解于蒸馏水定容至1.0L。
2.斐林试剂B液:200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·5H2O)与150gNaOH溶于蒸馏水中,并定容至1.0L。
A、B两液分别贮存,使用前按1:1体积混合。
(已配好)二、材料、仪器设备及试剂
25
0.1%葡萄糖标准液
烘干的纯葡萄糖100.00mg,加蒸馏水溶解定容至100ml
浓度:1.00mg/ml
(已配好)斐林试剂(蓝色)Cu2O砖红色不溶于水26三、实验方法与步骤
1.标准曲线的制作取5支试管编号,按下表分别加入各试剂。项目123451.标准葡萄糖液(ml)0.002.004.006.00样品液
6ml2.H2O(ml)6.004.002.000.000.00每管葡萄糖含量(mg)0.002.004.006.00
待测3.斐林试剂量(ml)4.004.004.004.004.00
A590值A1A2A3A4A5
吸光值差值(ΔA590
)A1-A1A1-A2A1-A3A1-A4A1-A527处理方法:
加斐林试剂后摇匀,加盖沸水浴中15min,自然冷却转入离心管,平衡后放入离心机!!离心:2500r/min5min
小心取出,取上清液测吸光值28标准曲线绘制:以葡萄糖量(mg)为横座标,吸光度差值(ΔA590
)为纵座标,在座标纸上绘制出标准曲线。比色测定:
用H2O作调0空白参比液!
在590nm波长下测定各管的吸光度。
ΔA590葡萄糖mg0292.0~3.0g样品—→加水研磨成匀浆后无损转入50ml大试管(25ml左右)—→80℃水浴20-30min(间歇震荡)—→冷却后转入100ml容量瓶定容、过滤后得到待测溶液。
取待测液6.0ml进行测定(按制作标准曲线的步骤)。2样品还原糖提取与测定30W=g;VT=100ml;Vs=6ml;A590及ΔA590填入工作曲线表作式作曲线图由工作曲线查得样品的还原糖含量为C=?mg四、数据记录31样品还原糖的含量(%)=五、结果计算
(X:根据标准曲线查得的糖质量mg;VT:提取液总体积(mL);W:样品鲜质量(g);Vs:测定时取用的样品体积(mL);N:样品稀释倍数)322种温度水浴处理,不可弄混离心机使用注意安全。思考:比较双缩脲试剂与斐林试剂的差异?思考:比较本实验与蛋白质测定实验中的化学原理差异?注意事项与思考:淀粉酶活性的测定(P174)实验04一、目的二、原理淀粉α-淀粉酶(内切酶)β-淀粉酶(外切酶)麦芽糖等寡聚糖麦芽糖3,5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)淀粉酶的作用机制及产物显色原理:540nm比色测定淀粉酶活性大小的表示方法:淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。测定α-淀粉酶和β-淀粉酶:α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热,本实验采用70。C保温15min钝化β-淀粉酶而测出α-淀粉酶。总活力减去α-淀粉酶活力则为β-淀粉酶活力。三、材料、仪器设备及试剂材料:萌发的小麦种子(芽长1cm)仪器设备:分光光度计、恒温水浴、刻度试管、容量瓶试剂:
1、标准麦芽糖溶液(1mg/mL)
2、3,5-二硝基水杨酸(含NaOH)
3、1%淀粉溶液四、实验步骤2、酶液制备称取1g萌发的小麦种子加少量蒸馏水研磨
转入100mL容量瓶定容放置15min
过滤淀粉酶原液(酶液Ⅰ)
取酶液Ⅰ10mL于50mL容量瓶,用蒸馏水定容
至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液(酶液Ⅱ)1、麦芽糖标准曲线的制作
A540=0.264x-0.052(x为mg麦芽糖)3、酶活力的测定取4支干净的具塞刻度试管,编号,按下表操作:摇匀,沸水浴中5min,取出流水冷却,加蒸馏水至20mL。摇匀,540nm比色测定。操作项目管号
Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅱ-1Ⅱ-2淀粉酶原液(酶液Ⅰ)/mL1.01.000钝化β-淀粉酶置70。C水浴中15min,取出后流水冷却淀粉酶稀释液(酶液Ⅱ)/mL001.01.03,5-二硝基水杨酸/mL2.002.00预保温40。C恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液/mL(40。C)1.01.01.01.0保温40。C恒温水浴中保温5min3,5-二硝基水杨酸/mL02.002.0空白管:2mL蒸馏水+2mL3,5-二硝基水杨酸,沸水浴5min,定容至20mL五、实验数据VT=VS=W=N=5AⅠ-1=AⅠ-2=△A1=AⅠ-2-AⅠ-1x1=AⅡ-1=AⅡ-2=△A2=AⅡ-2-AⅡ-1x2=六、结果计算X1×VTα-淀粉酶活力[mg/(g.min)]=
W×VS×tX2×VT×N(α+β)-淀粉酶活力[mg/(g.min)]=
W×VS×tβ-淀粉酶活力=(α+β)-淀粉酶活力-α-淀粉酶活力七、分析讨论注意事项:1、三个水浴温度的不同,不能混淆。2、实验步骤较复杂,理解之后动手操作。43实验06
植物组织中总氮含量的测定
(微量凯氏定氮法)44
氮素代谢在植物新陈代谢中占有重要地位。测定氮素含量对于研究植物的营养生理,以及确定农产品品质、营养价值等均具有重要意义。动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类,主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定,测定出样品中总氮含量,再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量,则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来,再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。45一、原理在催化剂(如CuSO4、K2SO4、硒粉等)存在的条件下,将植物材料与浓硫酸共热,有机物氧化分解成CO2和H2O,其中的氮转变为氨,并进一步生成(NH4)2SO4,这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH,经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵;再用标准盐酸滴定,直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度,根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。46一、原理
以甘氨酸为例的化学反应式:消化:CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3
2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4蒸馏:(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O滴定:(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO347材料:面粉
仪器设备:消煮炉、海能K9840型自动凯氏定氮仪、Titrette滴定计、分析天平、消化管、蒸馏管、容量瓶、三角瓶、移液管等。
试剂:
1.浓硫酸(AR级);2.30-40%(W/V)NaOH;
3.2%硼酸溶液;4.0.01mol/LHCl标准溶液;
5.混合催化剂;6.混合指示剂;
7.30%H2O2;8.标准(NH4)2SO4溶液二、材料、仪器设备及试剂48简易凯氏定氮蒸馏装置海能K9840型全自动凯氏定氮仪49三、实验步骤1.样品消化(已完成)准确称取0.1-0.2g样品(依其含氮量而定)至消化管中,加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂,浸泡数小时后在管口盖一小漏斗,放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低,加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温,使消化管内液体达到微沸,直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。在消化过程中,可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒,应小心转动消化管,用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时,均应在通风橱中进行。502.定容:
消化液冷却后,沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁→冷却后转入100mL容量瓶,再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次,洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度,混匀后备用。513.蒸馏
(1)使用前仪器检查:检查无氨蒸馏水(蓝色标签)、NaOH(30-40%、黄色标签)、H3BO3(2%、红色标签)三个试剂瓶是否装有规定的试剂、瓶盖是否盖紧(切忌漏气);电源插头是否接通;冷却水源是否接牢。
(2)加样:取10mL样品消化液转入蒸馏样品管中,安装在定氮仪蒸馏管接口上(注意密接好);安放承接蒸馏液的三角瓶(集液瓶)。523.蒸馏
(3)开机:打开电源开关,仪器自动进入“自动、手动可选界面”。
(4)参数设置:按“确认”键上、下箭头调光标于自动处,按下确认键,进入“当前参数”界面。
参数值常规设置:稀释水量5mL、硼酸体积10mL、加碱体积10mL、蒸馏时间4-5min(第1个样品5min,以后样品4min)、淋洗水量5mL。533.蒸馏
(4)工作:仪器自动显示“集液瓶是否放置到位”。确认放置到位后按确认键,仪器按设定的程序和参数值进行自动蒸馏,蒸馏中显示顺计时工作状态。
蒸馏到预定时间,仪器停止工作且自动回复到“自动、手动”可选界面。
取下样品管和蒸馏液瓶用于滴定。(5)再次蒸馏:装上下一个待测样品管和集液三角瓶,按确认键3次后,仪器开始自动再次蒸馏。543.蒸馏
(6)空白蒸馏
用未加植物样品的消化液(其余试剂都加入并按同样方法进行消化)为空白液,按样品消化液的蒸馏方法进行蒸馏。
注意事项:
(1)参数修改:按“修改”键→使用“确认”键周围的上、下、左、右箭头键选择修改指标→输入设定指标值→设定完毕按确认键;
(2)从蒸馏仪上取样品管时,应戴上手套或用干抹布包裹操作,以防高温灼伤;
(3)杜绝用化学污染的手在界面上操作;
(4)当操作失误或出现异常情况时,按“急停”键停止工作;排除故障后,按“返回”键重新操作。554.样品及空白滴定
样品和空白蒸馏完毕后,分别用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定,直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终点,记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。
(滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL)56滴定计操作
(1)打开电源开关,将滴定阀旋至“循环”档;
(2)旋转操作手轮,排出汲筒管中空气,再反向旋转操作手轮至活塞和溶液上升到约一半位置;如此反复数次,直到汲筒管溶液中无大气泡;
(3)旋下滴定管保护螺帽,将滴定阀旋至滴定档,逆时针转动操作手轮,排出滴定管中气泡;
(4)按下清零按钮,逆时针缓慢转动操作手轮进行滴定。
(5)滴定完成后,记录滴定体积。按下清零按钮,进行下一轮滴定。数值清零按钮液晶显示屏计数暂停键操作手轮滴定阀电源开关保护螺帽汲筒管注意事项:(1)仪器昂贵,小心拿放;(2)滴定前确保接口密封;(3)各项操作不可用力过猛。57W=g(根据样品管编号在讲台上查表获得);VT=mL;Vs=mL;A=mL;B=0.2mL四、数据记录五、结果计算样品总氮含量(%)=
面粉粗蛋白含量(%)=样品含氮量(%)×5.70(C:滴定时标准盐酸溶液浓度(0.0100mol/L
);VT:消化液定容总体积(mL);W:样品质量(g);Vs:蒸馏时取样体积(mL);A:滴定样品所用盐酸体积(mL);B:滴定空白所用盐酸体积(0.2mL)
)六、分析讨论58为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术和检验实验的准确性及误差,常用已知浓度的标准硫酸铵溶液测试3次;定氮仪的样品管连接处不能漏气;取样品管时,小心避免强碱溅在身上引起灼伤或腐蚀衣物等;使用完毕,切记关好电源和冷却水源。注意事项:59实验07
抗坏血酸(Vc)含量的测定
(滴定法)60一、原理Vc具有很强的还原性,染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性,且在酸性溶液中呈红色,在中性或碱性溶液中呈蓝色。用草酸提取Vc,然后用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚溶液对其进行滴定时,Vc可将2,6-二氯酚靛酚还原成无色。但当Vc被消耗完后,再滴入少许2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈现红色,借此可指示滴定终点。根据标准2,6-二氯酚靛酚的用量,可以计算出被测样品中Vc的含量。
抗坏血酸又称为维生素c(Vc),在一般水果、果蔬中含量较高。测定Vc含量,可作为衡量果蔬品质指标之一。61材料:苞菜或其他果蔬
仪器设备:蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定管、漏斗、移液管等
试剂:
1.2%草酸;
2.碱性2,6-二氯酚靛酚溶液(蓝色);
3.0.1mg/mL标准Vc溶液(用草酸配制)二、材料、仪器设备及试剂2,6-二氯酚靛酚溶液(碱性、蓝色)62三、实验步骤1.样品提取
准确称取3g左右样品放入研钵中,加入2%草酸溶液约5mL研磨→匀浆液转入50mL容量瓶,用草酸洗涤研钵3次,洗涤液一并转入容量瓶中→用草酸定容至刻度→过滤,收集滤液,备用。2.空白滴定取2%草酸10mL至蒸发皿中,用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并在30s内不褪色为滴定终点,记录染料用量。63三、实验步骤4.样品滴定取样品滤液10mL至蒸发皿中,用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并在30s内不褪色为止。记录染料用量。3.染料标定取10mL标准Vc溶液至蒸发皿中,用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并在30s内不褪色为滴定终点。计算1mL染料相当于Vc的mg数,即滴定度(A)。64W=g;V1=mL;V0=mL;VT=mL;Vs=mL四、数据记录五、结果计算样品Vc含量(mg/100g)=(A:滴定度(mg/mL);V标:染料标定所用染料体积(mL);V1:滴定样品所用染料的mL数;V0:滴定空白所用染料的mL数;
VT:样品液定容总体积(mL);Vs:滴定时取样品溶液的体积(mL);W:样品质量(g))滴定度(mg/mL)A=六、分析讨论65样品Vc的提取和定容、标准Vc溶液的配制都要用2%草酸为溶剂;滴定时要边滴边搅拌蒸发皿中溶液。注意事项:实验06植物组织中DNA的提取与测定(P226)一、实验目的
1、提取DNA用于PCR等实验
2、了解核酸提取的原理、各试剂的用途等二、原理——盐溶法
1.盐溶法:DNA溶于1mol/L的NaCl溶液,而RNA则不溶
2.
破碎细胞:机械处理:超声波处理法、研磨法、匀浆法;化学处理:用SDS处理细胞。
3.
去除RNA:
DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液,RNA可溶;
DNA溶于1mol/L的NaCl溶液,而RNA则不溶;
RNA酶,酶解RNA
4.
去除蛋白质:加入SDS、高温变性、有机溶剂(氯仿+异戊醇)变性、柠檬酸、高氯酸等。
用高氯酸除去磷蛋白、糖类、磷脂、核苷酸类辅酶和游离核苷酸、酸溶性小分子物质等杂质。
氯仿除脂类分子5.
DNA酶失活:
DNA酶需二价离子Mg2+、Ca2+的激活,使用EDTA、柠檬酸盐螯合二价阳离子,基本可抑制DNA酶活性。
6.
DNA提取:不溶于一般有机溶剂,在乙醇中不溶形成沉淀。
7.
测定与含量计算:DNA在260nm处对紫外光吸收最大。对纯DNA样品来说,浓度为1
μg/ml时,DNA钠盐的OD260=0.02。即当A260=1时,dsDNA浓度约为50
μg/ml。三、材料、仪器、试剂
1.
材料:花棷菜、小麦芽等细胞分裂、DNA合成较旺盛的幼嫩组织器官。
2.
仪器:紫外分光光度计等。
3.
试剂:研磨缓冲液、10×SSC等、氯仿-异戊醇、高氯酸钠、SDS等。四、实验步骤1.
取花菜2-3g,剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。
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