常用分子生物学试剂的选择-中文

常用分子生物学试剂的选择赵秋伟用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶如何选择最合适的限制性内切酶限制性核酸内切酶的生物功能影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的生物功能

主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链细菌的限制与修饰作用

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R：编码限制性核酸内切酶

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M：编码限制性甲基化酶

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S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达主要特性I型II型III型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点异源三聚体多功能同源二聚体异源二聚体距识别序列1kb处随机性切割旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割GAGCC限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶单功能双功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶属名种名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株HindIII同一菌株中含多个不同的限制性核酸内切酶,表示在该菌株中发现这种酶的先后次序。限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI等产生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃PstI等产生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHPPvuII等产生的平头末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间措施：DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Sau3AI不受影响

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’影响限制性核酸内切酶活性的因素星号活性在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。远距离裂解酶(distantcleavage)：识别位点与切割位置不一致可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中

酶切反应注意事项价格昂贵的酶决不能用水稀释,以免变性失活。预先加入除酶以外的所有其他试剂。取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。使用无菌的新吸头。少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。

常用内切酶的单位价格比较

产品名称公司规格价格单位价格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR实验的不同需求DNA聚合酶的特性纯度稳定性酶活性PCR实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒

扩增效率

保真性

特异性基因组扩增、RT-PCR基因筛选、测序、基因克隆复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学复杂模板扩增、大规模基因检测特异性－热启动Taq酶原理

蜡封抗体抑制化学修饰特点

避免非特异性扩增提高PCR反应的特异性用途

基因组扩增

RT-PCR－热启动Taq酶特异性产品类型产品名称产品性能化学修饰天为时代:HotStart

Taq

Roche:FastStart

Taq

Abgene:Thermo-start®DNAPolymerase

Stratagene:SureStart™Taq

大大提高PCR反应的特异性化学修饰不影响后续实验抗体抑制

Invitrogen：

AccuPrimeTM

Taq

Platinum®

Taq

TaKaRa：ExTaqTM

HotStart

Version蜡封Promega：TaqBeadTM

HotStart保真性—高保真酶原理用途

表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低碱基错配率

保真性—高保真酶产品类型生物公司性能比较PfuDNAPolymerase

天为时代

Stratagene

Promega在目前已发现的所有耐热聚合酶中,Pfu保真度最高碱基错配率最低PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega高保真＋

高扩增效率原理混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用途超长片段扩增

－测序

－构建基因图谱复杂模板扩增－GC含量高－二级结构高保真＋高扩增效率特点产品性能高扩增效率天为时代：TaqPlus

TaKaRa：ExTaqTM

复杂模板扩增高保真天为时代：TaqPlatinum

Invitrogen：Pfx

Platinum

TaqHighFidelity

保真度低于Pfu聚合酶但扩增效率较高长片段扩增天为时代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：Elongase

AmplificaitonSystem

特别适用于保真度较高的超长片段扩增PCR

MasterMix原理预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂

PCRMasterMixPCR

MasterMix特点

快速简便减少加样误差和污染

灵敏度高

可扩增低至2个拷贝的目的模板

特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性

稳定性好长期放置活性无改变适用范围大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本

GC含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本可直接检测菌落，基因点突变检测,

或者阳性克隆的筛选。如何选择最合适的DNA修饰酶酶的作用DNA连接酶修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键连接多个平头双链DNA分子还可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。E.coliDNAligase作用于5’端带磷酸基团的DNA底物NAD+可促进该催化反应分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。用途:cDNA第二链合成。T4RNAligase催化单链DNA或RNA连接。主要用途是对RNA进行3＇末端标记以核酸为底物的水解酶按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶按作用位点分：内切或外切酶5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体外切核酸酶等。许多核酸酶兼有内切和外切活性核酸酶对核酸末端羟基进行磷酸化的酶用途：放射性标记DNA链的5‘末端，探针标记Maxam-Gilbert化学法的