环境生物技术5(19)-污染物的生物毒性效应研究方法(司)

有害物质的环境毒理学研究方法1第五章第六节

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5.6有害物质的环境毒理学

研究方法司万童内蒙古科技大学E-mail:siwt02@163.com生物分子细胞器细胞组织器官器官系统个体种群群落

生态系统2生物系统的各级生物学水平：污染物在生物化学和分子水平上的影响污染物在细胞和器官水平上的影响污染物在个体水平上的影响污染物在种群和群落水平上的影响化学污染物对生物的联合作用3主要内容：5.6.1污染物在生物化学和分子水平上的影响45污染物进入机体后导致的生物化学变化包括：防护性生化反应和非防护性生化反应。作用类型例子后果防护性混合功能氧化酶的诱导加快新陈代谢，生成水溶性代谢物，从而加速排泄金属硫蛋白的生成增加对金属的束缚速度，从而降低金属的生物利用率非防护性乙酰胆碱酯酶的抑制作用50％以上因抑制而产生可见的毒性效应DNA加合物的生成若导致突变会发生损害作用表2－1对污染物的防护性和非防护性生化反应什么是酶（enzyme）？酶是一种特殊的蛋白质，在生物体内对代谢活动起催化作用，本身不发生变化。受酶作用的物质称为基质（底物），在酶作用下的反应称为酶促反应。酶和污染物的相互作用污染物进入机体后，一方面在酶的催化下，进行代谢转化，另一方面也导致体内酶活性改变，影响酶的数量和活性。另外有些环境污染物对酶有诱导作用。目前已发现多种环境污染物能诱导生物体内一些酶的活性增加，例如：有机氯农药、多氯联苯、多环芳烃、表面活性剂、增塑剂和染料中间体等，均可对酶产生诱导作用。6(1)污染物对生物机体酶的影响污染物对酶辅助因子的影响一些污染物能与酶的辅助因子——金属离子作用，从而使辅助因子失活，影响到酶的活性。例如：氰化物等能与细胞色素酶中的铁离子结合，形成稳定络合物，而抑制细胞色素的酶活性，使其不能传递电子，则细胞内的氧化代谢过程中断，使机体不能利用氧，出现内窒息性缺氧。对酶活性中心的影响污染物还能和酶的其它活性基团结合，如汞和砷与某些酶的活性基团结合就很牢固，从而使酶失去活性。破坏酶的结构有些污染物能够取代酶分子中的某些成分，从而使酶失去活性。如铍的毒作用机理就是能取代某些酶分子中的镁和锰，破坏了酶的正常结构，使酶失去活性。7与酶激活剂作用有些酶需要激活剂才能表现活性。酶激活剂往往是金属离子，凡是能与激活剂作用的污染物都能抑制酶的活性。污染物与基质竞争同种酶而抑制酶的作用污染物与底物有相似的结构，也能与酶形成复合物，从而竞相和酶发生作用。酶的抑制不可逆性抑制非竞争性抑制竞争性抑制8混合功能氧化酶（MFO）MFO是污染物在体内进行生物转化相I过程中的关键酶系，它们对人工化学品解毒发挥了重要作用。MFO引起的生物转化的反应特征相同，但底物、产物的化学特性差别很大，即具有多种催化功能。混合功能氧化酶（MFO）的作用MFO存在于所有的脊椎动物和大部分的无脊椎动物中，其作用是代谢非极性的亲脂性有机化合物，包括内源性化合物和外源性化合物。从解毒作用来看，许多外源性化合物进入体内，经MFO作用后发生各种变化，大多数被转化成低毒易溶的代谢产物排出体外。但有的则变成高毒甚至致癌物。9①

混合功能氧化酶（MFO）活性氧（ActivatedOxygen）带有2~3个电子的分子氧还原产物，主要有：·OH、O2-、H2O2活性氧的控制和消除由体内产生的活性氧可为抗氧化防御系统控制，消除活性氧对机体的伤害作用。某些污染物如多环芳烃、多氯联苯在生物体内进行生物转化时产生大量活性氧。在一定范围内，这些活性氧可被体内的抗氧化防御系统清除，但当体内的抗氧化防御系统不能消除这些活性氧时，它们可使DNA链断裂、脂质过氧化、酶蛋白失活等，从而引起机体氧化应激或氧毒性。抗氧化防御系统酶超氧化物歧化酶（SOD）谷胱甘肽氧化酶（GPx）过氧化氢酶（Ct）10②抗氧化防御系统酶污染物对生物大分子的影响主要表现在以下方面：干扰正常的受体——配体的相互作用受体（receptor）是许多组织细胞膜上的大分子成分，配体（ligand）是生物体内的一些具有生物活性的化学物。正常情况下，受体与配体结合形成受体－配体复合物，产生一定的生物学效应。生物膜损伤不少环境化学物通过改变膜脂流动性，影响膜的通透性和镶嵌蛋白质的活性，改变其结构和稳定性，从而产生生物效应干扰细胞内钙稳态正常情况下细胞内的钙浓度较低（10－7～10－8mol/L），细胞外浓度较高（103mol/L

）。各种细胞毒物，如硝基酚、过氧化物、汞、铅等重金属离子均能干扰细胞内钙稳态，引起细胞损伤和死亡。11（2）

污染物对生物大分子的影响干扰细胞能量的合成一些环境污染物可干扰糖类的氧化，使细胞不能合成能被生物利用的ATP，ATP使细胞生命活动得不到充足的能量供给脂质过氧化(lipidperoxidation)与自由基

脂质过氧化是细胞损伤的一种特殊方式,是由于产生了自由基而引起的,正常情况下,生物体内氧化、还原和酶促反应过程中，均可产生少量自由基，一般可被体内存在的抗氧化物质（如维生素C、维生素E）所对抗，对生物危害不大。当大量污染物（自由基）进入机体，造成机体抗氧化作用失衡，即可发生脂质过氧化，对生物体造成危害。与生物大分子共价结合共价结合可改变生物大分子的结构和功能，引起一系列生物学改变，特别是与酶蛋白、脂肪、核酸等重要生物大分子共价结合，能改变其化学结构，影响其生理功能，甚至导致变性和细胞死亡。12污染物对蛋白质的影响主要表现在以下方面：导致蛋白质化学损伤：细胞膜结构及通透性改变；影响酶的催化功能等诱导生物机体内一些功能蛋白的产生：如应激蛋白（StressProteins）和金属硫蛋白（Metallothionein）的产生，这些蛋白质的产生可保护生物机体抵抗污染物的损害。注：金属硫蛋白对二价金属离子具有极高的亲和力，在细胞内起贮存必需的微量金属如Zn、Cu和结合有毒金属如Cd、Hg的作用，它与必需金属的结合起调节这些金属在细胞内浓度的作用，而与有毒金属结合则可以保护细胞免受金属毒性影响。13例：污染物对蛋白质的影响外源性化合物及其代谢产物能引起DNA损伤，它们与DNA的相互作用过程有以下四个阶段：形成DNA加合物（DNAAddcuts）发生DNA的二次修饰DNA结构的破坏被固定当细胞分裂时，外源性化合物造成的危害可导致DNA突变及其基因功能的改变DNA加合物的形成是产生DNA损伤最早期的作用，随后产生的最重要影响是DNA结构的改变，如碱基置换、碱基丢失、链断裂等。DNA加合物作为一项生物指标来评价环境中化学污染物的遗传毒性的研究日益受到重视。14污染物对DNA的影响对细胞膜的影响主要表现在以下方面：污染物引起的脂质过氧化作用导致的损伤污染物可影响膜的离子通透性污染物与膜上的受体结合，干扰正常的生理功能155.6.2污染物在细胞和器官水平上的影响

（1）对细胞膜的影响在逆境胁迫下，植物体内产生大量活性氧自由基。活性氧很容易使植物细胞内膜发生过氧化作用或脱脂作用，而丙二醛则是细胞内膜脂过氧化或脱脂的产物，会严重地损伤细胞的生物膜，降低膜中不饱和脂肪酸的含量，使膜的流动性降低，作为间接衡量植物体内氧化损伤程度的指标。16镉-锌-砷单一及复合污染对浮萍的毒性效应

同一浓度处理水平下，单一重金属污染对浮萍丙二醛含量影响的大小依次为Cd>Zn>As。与单一污染相比，复合污染对浮萍丙二醛的生态毒性效应情况则较复杂，As+Cd对浮萍丙二醛含量的影响是因为两者呈现拮抗作用的结果，对浮萍细胞膜增透作用较弱。而其他3种复合污染在低浓度时对浮萍丙二醛含量影响较大，在高浓度时影响作用下降。同一浓度处理水平下，单一重金属污染对浮萍的生态毒性效应表现在对叶绿素的损伤程度为Cd>Zn>As，与单一污染相比，As+Cd和Zn+Cd复合污染对浮萍毒性增强，表现为协同作用，加强了对浮萍叶细胞的伤害；而As+Zn和As+Zn+Cd复合污染对浮萍的联合毒性作用趋向于毒性减少的拮抗作用。17线粒体线粒体是细胞供能的场所。污染物可引起其结构改变，从而影响线粒体的氧化磷酸化和电子传递功能光面内质网和糙面内质网光面内质网和糙面内质网是进行激素和外源性化合物的代谢场所。糙面内质网：通过附着或解离核糖体控制蛋白质的合成例：多种化学致癌物如黄曲霉毒素能引起核糖体脱落，导致蛋白质合成控制的改变。18（2）对细胞器的影响三个概念：靶器官、效应器官和蓄积器官注1：靶器官不同于效应器官，污染物的毒作用可以通过靶器官表现处来，也可由另外的效应器官表现出来。注2：靶器官不同于蓄积器官，污染物在蓄积器官内的浓度高于其他器官，但对蓄积器官并不一定显示毒作用。对组织器官的影响对植物，表现为叶面出现点、片伤害斑，造成叶、蕾、花、果实等的脱落对动物，以重金属污染为例：铅可损害造血器官和神经系统，镉可损害肝脏、肾脏，导致骨痛病。19（3）

污染物对组织器官的影响污染物对植物在个体水平上的影响：主要表现为生长减慢、发育受阻、失绿黄化、早衰等污染物对动物在个体水平上的影响：主要表现为死亡、行为改变、繁殖下降、生长和发育抑制、疾病敏感性增加、代谢率变化205.6.3污染物在个体水平上的影响衡量致死效应的指标死亡率：死亡比例的大小，为评价污染物毒性大小的生物学指标。致死剂量（LethalDose）或致死浓度（LethalConcentration）：能引起动物死亡的污染物的剂量或浓度。半数致死剂量（LD50）或半数致死浓度（LC50）：能引起50％的动物死亡的污染物的剂量或浓度。影响致死效应的主要因素：污染物的种类及其物理化学性质生物的种类作用时间、水质条件，如温度、硬度、溶解氧等多种污染物的综合作用21（1）致死效应行为毒性（BehavioralToxicity）的概念指一种污染物或其他因素（如温度、光照、辐射）使得动物一种行为超过正常变化的范围。水环境污染可影响的生物行为：回避行为捕食行为学习行为警惕行为社会行为对鸟类行为的影响有机磷农药可影响鸟的神经系统，导致鸟的平衡和协调性的损害。受污染的鸟类还可表现出对领地的失控和不能照顾后代。22（2）对行为的影响污染物对繁殖的影响主要表现为：产卵数、孵化率、幼体存活率下降以及繁殖行为下降等。概念：环境激素（EnvironmentalEndocrineDisrupters）指具有动物和人体激素的活性，能干扰和破坏野生动物繁殖障碍、诱发人类重大疾病的天然物质或人工合成物质。也叫做外源性雌激素或环境内分泌干扰物。环境激素的种类包括：天然雌激素、合成雌激素、植物雌激素、具有雌激素活性的环境化学物质。注：具有雌激素活性的环境化学物质：如杀虫剂、多氯联苯、多环芳烃、洗涤剂、塑料添加剂、食品添加剂等，工业废水和生活污水往往含有上述物质。23（3）对繁殖的影响污染物对生长和发育的影响可通过生长指示器来测定生长指示器（ScopeforGrowth）是反映生物机体能量获取利用和代谢的综合指标。

P=A-(R+U)注：P——SFG；A——从食物获得的能量；R——呼吸作用的能量损失；U——排泄作用的能量损失24（4）对生长和发育的影响概念：种群（Population）是指在一定时空中同种个体的组合。污染物对种群的影响表现为：种群数量的密度改变结构和性别比例的变化：年龄结构、种群大小、性逆转遗传结构的改变：在进化过程中通过改变基因频率以适应环境的改变。竞争关系的改变255.6.4污染物在种群和群落水平上的影响

（1）

对生物种群的影响基本概念群落（Community）优势种（DominantSpecies）优势度？？耐污种敏感种污染物对群落的影响表现在：群落组成和结构改变对物种多样性（SpeciesDiversity）的影响注：物种多样性指群落中物种的数目（丰富度）和各个物种的相对密度（群落的异质性）。26（2）对生物群落的影响联合作用(CombinedEffect)的概念指两种或两种以上化学污染物共同作用所产生的综合生物学效应。联合作用的类型：相加作用（AdditiveEffect）：污染物的总作用强度等于其各个成分单独作用强度的总和。协同作用（SynergisticEffect）：污染物的总作用强度大于其各个成分单独作用强度的总和。独立作用（IndependentEffect）各污染物对机体的侵入途径、方式、作用部位、产生毒作用的机理各不相同，因此产生的生物学效应彼此无关。拮抗作用（AntagonisticEffect）：污染物的总作用强度小于其中任何一种成分的单独作用强度。275.6.5化学污染物对生物的联合作用细胞色素P450的研究进展DNA加合物的形成与诊断研究进展28（1）研究进展细胞色素P450（cytochromeP450或CYP450,简称CYP450）：一类以还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质。固醇类生物合成、脂肪酸和类固醇激素等内源性底物的氧化代谢；大部分药物和外源物的生物氧化等；它使进入机体的外源物经代谢后向两个方向发展：代谢解毒和代谢活化；代谢活化后的产物有较强的毒性,甚至产生致畸、致癌效应。29（2）细胞色素P450参与的生化反应与作用30（3）细胞色素P450的生化背景31（4）细胞色素P450作用原理32反应式据统计,人类每年合成数以千计的新化合物并排放到环境之中,这些化合物许多具有遗传毒性。如何对这些化学物质进行监测和评价是一项十分艰难而重要的工作。检测周围媒体(大气、水、土壤等)中化合物含量水平来评价有毒物和人体健康之间的关系是不够的,因为这种外剂量的评价方法只能给出生物体可能接受的大概剂量,而不能给出一定的信息来说明生物体对毒物的吸收、代谢、生物效应等的差异。随着研究的深入,人们提出应用大分子(蛋白质、RNA、DNA)加合物来研究和评价具有遗传毒性的化学物质致癌风险性。它们不仅能反映化学物质及其代谢产物在组织或体液中的剂量,而且能够提供实际到达的作用部位或与关键的细胞大分子反应的确切剂量。其中DNA加合物由于意义重大而成为多学科如环境科学、预防医学、临床医学等领域当前的国际研究热点。33（5）加合物的研究意义

DNA加合物的形成毒性机理形成过程

DNA加合物的诊断色谱-质谱法

32P-后标记法免疫学法34（6）DNA加合物的形成与诊断研究进展DNA加合物就是亲电性的化合物或其代谢产物和生物体内大分子形成共价相连的化合物,是DNA化学损伤的最重要和最普遍的形式。这种加合物一旦逃避自身的修复,就可能成为致突、致畸、致癌的最小因子,因此DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。研究表明DNA加合物的形成与肿瘤的发生、发展之间存在着因果联系和剂量——反应关系。35（7）DNA加合物与肿瘤DNA加合物的形成是遗传毒性物质导致生物体遗传毒性的前提,含DNA加合物的DNA分子未能被修复或被细胞错误地复制,将会导致一系列基因突变而产生遗传毒性。大多数遗传毒性化学物质如PAHs在生物体内一般首先经过存在于许多生物组织中的混合功能细胞色素氧化酶P450的代谢。它们形成DNA加合物的途径有2种：1)通过单电子氧化途径;2)通过混合功能细胞色素氧化酶P450的激活。化合物氧化途径活化并且生成嘌呤加合物,大多数通过单电子氧化途径形成的DNA加合物具有不稳定的糖苷结构,能自动地使嘌呤脱落而形成一无嘌呤位点,这个位点被认为DNA分子上的一个致突变损伤,同时这些无嘌呤位点也有可能是一些化合物致癌的主要原因。36（8）毒性机理

许多污染物是亲电化合物,它们具有低电子密度中心,因此可以与具有高电子密度的分子(如具有亲核中心的DNA分子或蛋白质分子Y)反应,形成生物大分子加合物.大多数亲电子剂(RX)的加合物形成机理是亲核替代,亲电子基团通过亲核原子(O、N、S等)的一对不共享的电子(∶或-与之形成一个新的共价键.如式(1)所示被替代基团(X)。根据反应物性质的不同或被亲核基团(Y)中和或带上了负电：37（9）形成过程（10）DNA加合物与致癌关系DNA加合物是化学致癌过程的一个早期、可检测的重要步骤，通过DNA加合物与突变和致癌关系的研究，人们认识到DNA加合物可能是化学致癌物与癌症之间的一个分子桥梁。有可能用于肿瘤防治的早期生物监测，对化学致癌机理的探讨及肿瘤病因的研究具有重要意义，并可最终为肿瘤的预防和治疗服务。38（11）DNA加合物的形成机制DNA呈双链超螺旋结构存在于细胞中,嘌呤和嘧啶碱基重于螺旋内侧。在DNA的4个碱基中,存在着N、O、P、等原子,这些原子都含有孤对电子,容易受到亲电试剂的攻击。研究表明,在DNA分子至少有12个位点易受到化学致癌剂的攻击。对于大多数致癌物都是经过代谢活化后变成亲电的代谢物后,再与DNA发生共价结合的,但也有直接结合的化合物。39

目前最常用的诊断、检测及定量分析加合物的方法,原理是根据复杂样品中的各组分在流动相和固相间具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,各组分便在两相中进行溶解、吸附、脱附的多次反复分配,达到彼此分离的结果.这种色谱分离技术与适当的检测手段(如电化学检测器等)相结合时,就构成了色谱分析法.当前最成熟的联用仪是色谱/质谱联用仪。该法的优点是灵敏度高、特异性强、用于检测极微量加合物的存在及研究其形成机理。GC-MC和LC-MC在分析蛋白质加合物中有重要作用.毛细管气相色谱与质谱联合分析是目前灵敏度最高的技术之一,目前已研制出毛细管区带电泳分离与质谱联用技术,并被应用于加合物的诊断、分离和检测。40（12）色谱-质谱法DNA加合物的诊断高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)联合其它敏感的检测法检测DNA损伤已成为一种趋势。如HPLC-32P后标记方法是非常敏感的方法。气/质联用法(GC/MS)虽然灵敏度稍低，但可以提供加合物准确的结构信息，这一点是其它方法不能比拟的。目前该方法多用于尿中排泄的DNA加合物的检测，需水解DNA才能测定。其敏感性与荧光法相似。41（13）高效液相色谱法及气/质谱法Gupta于1982年就建立32P后标记法(32P-PostlabelingAssay)来诊断、检测生物体中形成的DNA加合物.一种非常灵敏的诊断方法,灵敏度为1个DNA加合物/1×109～1×1010核苷酸.该法的基本原理是,与外源性物质形成加合物的单核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被标记上32P,从而通过放射性的定量分析诊断、检测所形成的DNA加合物.此法的优点是检测能力强所需DNA的样品量少,非常适合只能提供少量DNA的人体样本(几个微克)的检测,不需要事先制备加合物标样,用空白对照可以定量计算加合物含量,既可用于单一加合物的检测,也可用于复杂混合物的测定,及未知的内源性亲电性物质所形成的加合物的测定,应用范围广,可适用于检测不同类型的化学污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不饱和醛类以及活性氧、紫外线辐射等所引发的DNA加合物,尤其是可用于生态毒理学研究中生物样品的加合物测定以及判断化合物的生态毒性.其缺点是特异性较差,步骤比较多,稳定性不易掌握,不同的实验室所测定的结果差别很大。在定量水平上存在局限性,因此有必要同其它检测方法结合起来进行应用.42（14）32P-后标记法

--为国际公认的最有发展前途的方法DNA加合物的诊断Sabtella等于1988年创建了酶联免疫吸附测定法(ELISA),该方法用生物大分子加合物抗体(单克隆体或多克隆体)来诊断、检测靶组织中的相应加合物及其含量,可以在特异的组织或细胞中进行定位研究。其测定DNA加合物的灵敏度为1个DNA加合物/1×107～1×108核苷酸。该方法的基本原理为抗原抗体反应,通常需要结合其它的富集、分离及检测加合物的方法来得出最佳测定效果。其优点是费用低,简便易行,无须接触高水平的暴露量,适用于大量人群流行病学调查的研究。其缺点为所需样本量大,抗体间存在交叉反应,对于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能进行检测。43（15）免疫学法DNA加合物的诊断基本原理是抗原与抗体的反应。已发展的方法有竞争性放射免疫测定(RIA)；固相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)；超敏酶促放射免疫测定(USERIA)等。其检测限一般为1个加合物/1×107～1×108核苷酸,目前已有20多种单克隆多克隆抗体可供使用。免疫法的优点是简便易行,价廉,不需要酶解DNA链,用免疫沉淀技术可以将有加合物的DNA链和无加合物的DNA链分离，适用于大量人群流行病学调查的研究。其缺为点是抗体存在交叉反应,所需DNA量较大(25～60Lg)。另外对于非抗原性加合物和未知抗原加合物的检测无能为力。44免疫学法荧光测定法的原理是通过某些化合物的加合物具有荧光特性而进行定量,其灵敏度为1个加合物/106～108核苷酸,所需样品量为100μg左右.

荧光法的优点是不破坏生物大分子链,并可区分出加合物的不同立体异构体及大分子链不同位点上的加合物.荧光法还可用于研究DNA加合物的形成或修复与时间之间的动态关系,但不适用于检测发光的化合物.45（16）荧光测定法DNA加合物的诊断原理是通过某些化合物(特别是多环芳烃)的DNA加合物具有荧光的特性来测定,其检测限为1个加合物/106-8核苷酸,目前发展的技术有同步荧光色谱法,激发-发射荧光法,低温激光法。荧光法的优点是不破坏DNA链就可以测定,另外可以确定加合物的不同立体异构体及DNA链上的不同位点上的加合物,