王金福生物化学PPT01

制作：王金福生物化学教学课件

生物化学(Biochemistry)：生命的化学,在分子水平探讨生命的本质。研究对象：生物。生物化学的主要任务是阐述活细胞内及细胞间的化学反应及其与生命活动的关系。主要内容:1、研究生物分子的结构及功能。生物大分子是由某些基本单位按一定顺序和方式连接所形成的多聚体（polymer）。包括蛋白质、核酸、脂类及糖等。2、新陈代谢及其调节。3、遗传信息的贮存、传递、表达及调控（分子生物学）。绪论国外生物化学的发展1、18世纪下半叶前：“燃素说”；2、18世纪下半叶：（1）拉瓦锡：证明燃烧是氧的作用；（2）舍勒：发现柠檬酸、苹果酸等生物中间代谢产物；3、19世纪以后：李比希（1803~1873，德国化学家）：首创大学化学实验的教学，首次提出新陈代谢；霍佩-赛勒（1825-1895，德国医生）：建成独立的生物化学学科，并提出“Biochemie”和“蛋白质”一词；寇南（1837-1900，德国化学家）：提出胰酶的名词，研究血红蛋白和胰液对蛋白质的消化；4、20世纪以后生物化学的发展

1902年德国艾贝尔首次获得结晶肾上腺素；

1904年英国哈顿分离出“辅酶”，还发现了磷酸基在生化中的重要作用；1902~1907年德国埃·费歇证明蛋白质由氨基酸组成，开始了蛋白质结构研究的时代；1909年丹麦威约翰逊在《精密遗传学原理》一书中首次提出基因是遗传单位的概念；1912年波兰的丰克分离出维生素B结晶，首次提出维生素的概念；1925年英国凯林发现细胞色素，并指出生物氧化过程中的电子传递作用；1926年美国萨姆纳首次制成尿素酶，开辟了酶化学的研究。同年美国的摩尔根发表《基因论》，使基因遗传理论系统化；1929年美籍俄国人勒温发现核酸中的核糖和脱氧核糖，认识到核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类；同年德国罗曼发现ATP。1937年美国罗思发现组成蛋白质的氨基酸分为两类，其中一类对营养无效，另一类是20余种基本氨基酸；同年英籍德国人克勒勃斯发现三羧酸循环；1941年德国李普曼发现ATP高能键在代谢过程中的重要作用；并在1947-1951年发现乙酰CoA在TCA循环中的重要地位；1953年美国华特森和英国克里克根据维尔肯做DNA的X

光衍射资料，提出DNA一级双螺旋的分子结构模型；1954年美籍俄国人伽莫夫首次提出一个核苷酸编成一个遗传密码的“三联密码说”。1961年克里克加以了证实；1955~1956年美籍西班牙人奥巧阿和美国孔勃首次用酶促法人工合成核糖核酸RNA和DNA；1961年法国雅各布和莫诺首次提出mRNA的存在，证实

mRNA与DNA的碱基互补以及蛋白质的合成场所---核糖体，同时发现了操纵子的基因集团；80年代发展了生物工程和生物技术。人类基因组计划（humangenomeproject）：美国RenatoDulbecco在1985年提出,美国政府1990年10月正式启动,耗资30亿美元，旨在画出一张人体地图,找到46条染色体上30亿个碱基对约10万个基因的准确位置，破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自己。是生命科学领域有史以来最宠大的全球性研究计划，“生命登月计划”。2000年6月26日,克林顿亲自在白宫发表了人类基因密码组合草图。后基因组计划将进一步深入研究各种基因的功能与调节。拿着基因组图谱去看病；10年内基因检测会成为例行手段；基因疗法会成为常规疗法。

中国近代生物化学的发展吴宪与汪猷、张昌颍等人一起完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。

1965年，我国首次人工合成了结晶牛胰岛素。

1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。本世纪末我国参与了人类基因组计划。生物化学与临床医学1、Alldiseasehasabiochemical

basis.2、Biochemicalstudiescontributetodiagnosis,prognosisandtreatment.3、Manybiochemistrystudiesilluminatediseasemechanismsanddiseaseinspireresearchinspecificareaofbiochemistry。总目录第一篇生物大分子的结构与功能第二篇物质代谢及其调节第三篇基因信息的传递第四篇专题篇第一编生物大分子结构与功能第一章蛋白质的结构与功能第二章酶第三章维生素与辅酶第四章核酸的结构与功能第一章蛋白质的结构与功能第一节氨基酸与多肽第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质及分离纯化

蛋白质的元素组成碳、氢、氧，还有氮和少量硫等C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各种蛋白质含氮量接近，平均为16%。

1克氮相当于6.25克蛋白质为测定样品中蛋白质含量的依据。凯氏定氮法测定蛋白质含量：蛋白质含量=蛋白氮×6.25蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子，包括：

1、简单（单纯）蛋白质：完全由氨基酸构成；

2、结合（缀合）蛋白质：还有非蛋白质成份的辅基或配基。蛋白质构象：每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构，这称为蛋白质构象。蛋白质结构的不同组织层次：1、一级结构：多肽链共价主链的氨基酸顺序；2、二级结构：多肽链以氢键排列成沿一维方向的周期性结构的构象，如纤维状蛋白质中的-α螺旋和-β折叠片；3、三级结构：多肽链以各次级键（非共价键）盘绕成具有特定走向的紧密球状构象；4、四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互结合方式。第一节氨基酸与多肽一、氨基酸及其分类组成蛋白质的20种氨基酸均为L-α-氨基酸HCOO-RH3N+L-氨基酸通式

与羧基相邻的α-碳（Cα）上都有一个氨基，因此称为α-氨基酸。α-碳上还连着一个H和一个可变的侧链R基，各种氨基酸的区别在于R基的不同。1、非极性疏水性氨基酸20种氨基酸按侧链R的理化性质分为4类：2、极性中性氨基酸3、酸性氨基酸4、碱性氨基酸人体必需氨基酸有八种：

MetTrpLysValIleLeuPheThr

“假设来借一两本书”脯氨酸为亚氨基酸。2H-OOCCHCH2SH+NH3HSCH2CH-OOC+NH3-OOCCHCH2SSCH2CH-OOC+NH3+NH3二硫键胱氨酸半胱氨酸（Cys）常以胱氨酸的形式存在二、氨基酸的理化性质一、氨基酸的旋光性除甘氨酸外，其余的α-碳原子为不对称碳原子，其结合的四个不同的取代基在空间的排列可有两种形式：L型和D型。

L型：氨基在左边D型：氨基在右边

D-α-氨基酸L-α-氨基酸

它们互为光学异构体。此外，苏氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸等还有一个不对称碳原子，所以可存在4种光学异构体（p.143，图3-15）。

二、氨基酸的酸碱性质（一）氨基酸的兼性离子形式：氨基酸能使水的介电常数增高，这是因为氨基酸在晶体和水中主要以兼性离子（偶极离子）的形式存在：

偶极离子形式的氨基酸是强极性分子，这就增加了水的介电常数。

(二）氨基酸的两性解离：酸与碱的关系：HA（酸）←→A-（碱）+H+（质子）酸是质子（H+）的供体，碱是质子的受体。氨基酸在水中的偶极离子既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用：因此是一类两性电解质。思考:为什么定量测定氨基酸的常用方法是甲醛滴定?

（三）氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况与溶液的pH有关，改变pH可使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可使其处于正负电荷数相等，即净电荷为零的兼性离子状态。这时的溶液pH值即为该氨基酸的等电点（pI）（见p.131，图3-9）。在等电点以上的任一pH，氨基酸带净负电荷，并因此在电场中将向正极移动；在低于等电点的任一pH，氨基酸带正电荷，在电场中将向负极移动。三、氨基酸的化学反应（一）α-氨基参加的反应1、与亚硝酸反应：生成氮气

可根据氮气体积，进行氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定（生成的氮气只有一半来自氨基酸）2、与酰化试剂反应：氨基被酰基化

酰化试剂可被用作氨基的保护剂3、烃基化反应：氨基中的H原子被烃基取代

可用来鉴定N-末端氨基酸4、形成西佛碱反应：氨基与醛类反应形成弱碱

是某些酶促反应的中间产物（如转NH2反应）

（二）α-羧基参加的反应1、成盐和成酯反应：与碱作用生成盐；与醇反应生成酯

2、成酰氯反应：在氨基被保护下，羧基与五氯化磷等作用生成酰氯

可使羧基活化，易与另一氨基酸的氨基结合，在人工多肽合成中使用。

3、脱羧反应：在氨基酸脱羧酶作用下，放出CO2而生成相应的一级胺（三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应

1、与茚三酮反应：在弱酸中与茚三酮共热，引起脱氧、脱羧反应，最后茚三酮再与产生的NH3和还原茚三酮作用生成紫色物质

可定性或定量（分光光度法和测压法）测定各种氨基酸。脯氨酸和羟脯氨酸反应生成黄色物质2、成肽反应：氨基酸与氨基酸之间的氨基与羧基可缩合成肽，形成肽键H2NCHCOOHR1+H2NCHCOOHR2H2NCHCONHCHR1R2COOH肽键H2二肽O三、氨基酸混合物的分析分离一、分配层析层析系统：固定相（静相）

，流动相（动相）

。动相可以充满静相的空隙中，并能流过静相。物质可以在动相和静相之间发生分配。氨基酸混合物中各种氨基酸成分在一定的动相和静相之间的分配系数有差异，当动相流经静相时，不同分配系数的氨基酸就会随着动相流经静相时在两相之间发生不同的连续分配，从而将不同的氨基酸分离开。二、分配层析种类1、分配柱层析

5、气液相层析2、纸层析

6、高效液相层析3、薄层层析4、离子交换层析：氨基酸分析仪1、分配柱层析固定相：层析柱中的填充物结合一层不会流动的结合水流动相：沿固定相流过的溶剂填充料似无数的微观“分溶管”，当流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间发生连续分配，这样不同分配系数的各种成分沿柱以不同速度向下移动。2、纸层析固定相：滤纸纤维素上吸附的水流动相：展层用的溶剂将氨基酸混合物点在滤纸的一个角上（原点），然后在密闭的容器中用溶剂沿滤纸的一个方向展层。然后旋转90o，再用另一溶剂进行第二向展层。由于各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的分配系数，由此彼此分开。3、离子交换层析固定相：阳离子交换树脂或阴离子交换树脂流动相：洗脱液阳离子交换树脂含有酸性基团，可解离H+离子而使树脂带负电荷。在酸性环境中，氨基酸阳离子可与H+发生交换而“结合”在树脂上；阴离子交换树脂含有碱性基团，可解离出OH-离子而使树脂带正电荷。在碱性环境中，氨基酸阴离子可和OH-发生交换而“结合”在树脂上。逐步改变洗脱液的pH和盐浓度（离子强度），可将各种氨基酸以不同速度洗脱下来.四、多肽

（一）肽键与肽链H2NCHCOOHR1+H2NCHCOOHR2H2NCHCONHCHR1R2COOH肽键H2O二肽寡肽(oligopeptide)多肽(polypeptide)氨基酸残基(reside):主链、侧链氨基末端(aminoterminal)或N末端羧基末端（carboxylterminal）或C末端H2NCHCONHCHR1R2CONHCHR3CONHCHR4COOH主链侧链N末端C末端（二）重要的多肽1、谷胱甘肽（Glutathione，γ-GSH）

谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

GSH具有重要的功能：1）解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外。2）维持红细胞膜的完整性。3）参与高铁血红蛋白的还原作用。4）促进铁的吸收。2、多肽类激素：促甲状腺素释放激素。3、多肽类抗生素：短杆菌肽4、酪蛋白磷肽（促进钙吸收剂CPP）CPP分子中具有丝氨酸磷酸化结构，肠道内有钙能与CPP上的磷结合使之成为可溶性钙，利于小肠对其吸收。一、蛋白质的分类按组成分类:单纯蛋白质：如血清清蛋白结合蛋白质：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白、色蛋白。按溶解度分类：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、硬蛋白、组蛋白、精蛋白。按分子形状分类：纤维状蛋白质：分子构象呈纤维形，长/短轴之比大于10，多为结构蛋白，难溶于水。球状蛋白质：近似球形或椭圆形，多数可溶于水或盐溶液。第二节蛋白质的分子结构二、蛋白质的一级结构（PrimaryStructure）蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年获Nobel化学奖。1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。蛋白质一级结构测定的意义许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白β亚基6位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。若β亚基6位Glu被Lys取代引起另一类贫血：血红蛋白C病。比较不同生物细胞色素C的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似。（一）肽和肽键结构1、肽链的结构特点是：（1）肽链中的骨干是单位规则地重复排列，称之为共价主链：

（2）每个肽键的形成都丢失一个水分子，故肽键中的氨基酸称氨基酸残基。（3）各种肽链的主链结构一样，但侧链R基即氨基酸残基的顺序不同。（4）一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称N端；另一端含一个游离的末端羧基，称C端。2、肽的命名：从N端氨基酸开始，称某氨基酰某氨基酰………某氨基酸，如简写：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu。

3、肽键的平面结构：

顺式构型中的两个Cα彼此接近，引起各R基之间的空间位阻，造成结构不稳；反在式构型中两者相距较远，结构比较稳定。肽链中的肽键全是反式构型。4、肽键共振（p.164，图4-2）：

肽键是一种酰胺键，通常在羰基碳和酰胺氮之间是单键，这样肽链主链上的3种键（Cα-C键，C-N肽键，N-Cα键）都是单键，所以原则上多肽主链上的任何共价键都可发生旋转。

但在酰胺氮和羰基氧之间会发生共振相互作用，其结果表现两种极端形式：

C和O之间有一个σ键和一个π键连接，而酰胺N上留有一个孤电子对，这种结构允许C-N键自由旋转（A）；

C和N原子参与π键的形成，在羰基O上留下一个孤e-对，带负电荷，酰胺N带正电荷，这样C-N键就成为一个双键，阻绕C-N键的自由旋转（B）。

肽键共振的结果：（1）阻绕肽键C-N的自由旋转，只保留N-Cα键和Cα-C键的旋转；（2）组成肽基的4个原子和2个相邻的Cα原子倾向于共平面，形成多肽主链的酰胺平面。（二）肽的物理和化学性质1、物理性质在水溶液中以偶极离子存在，这决定于游离末端α-NH2，α-COOH以及酸性和碱性氨基酸侧链R基团上可解离的功能团。肽键中的亚氨基不解离。2、化学反应（1）游离的-NH2和-COOH及R基团可发生与氨基酸中相应的基团类似的反应；（2）N末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量呈色反应；（3）双缩脲反应为肽和蛋白质所特有、而氨基酸所没有的一种颜色反应（紫红色或紫蓝色，与CuSO4碱性液反应），借助分光光度计可定量分析。（三）蛋白质的一级结构与功能一级结构的局部断裂与蛋白质激活有些蛋白质分子的部分肽链按特定方式断裂后才能呈现生物活性。1、血液凝固的机理：凝血酶致活物交联的纤维蛋白（血凝块）纤维蛋白溶解致活物

凝血酶原不溶性纤维蛋白纤维蛋白溶酶原

凝血酶（活性）纤维蛋白原纤维蛋白溶酶（活性）

纤维蛋白溶解

凝血酶致活物作用凝血酶原，使其分子中的二个肽键断裂。释放出一个N端片段后成为有活性的凝血酶（p.187，图4-21）；纤维蛋白原由2α条链、2β条链和2γ条链组成，在凝血酶作用下，从2条α链和2β条链的N端各断裂一个-Arg-Gly-键，释放出2个纤维肽A和2个纤维肽B，而剩下的纤维蛋白分子成为形成网状结构的不溶性纤维蛋白（p.188，图4-22，23）。

凝血酶致活物作用凝血酶原，使其分子中的二个肽键断裂。释放出一个N端片段后成为有活性的凝血酶；纤维蛋白原由2α条链、2β条链和2γ条链组成，在凝血酶作用下，从2条α链和2β条链的N端各断裂一个-Arg-Gly-键，释放出2个纤维肽A和2个纤维肽B，而剩下的纤维蛋白分子成为形成网状结构的不溶性纤维蛋白。

纤维蛋白原纤维蛋白单体纤维蛋白的生成及聚合暴露了粘合位点2、胰岛素原的激活：胰岛素原可分三部分：中间的连接肽（C肽），两侧的A链和B链。

C肽的一端通过两个碱性氨基酸残基（31、32位）与A链的C末端相连，另一端通过另两个碱性氨基酸残基（62、63位）与B链的N末端相连：

A链------31—32----C肽----62—63------B链

SSSS

在高尔基体内，特异的肽酶断裂二个特定的肽键，释放包括C肽的一段中间肽链后成为有活性的胰岛素（A链和B链以二个二硫键相连着）。

三、蛋白质的二级结构（secondarystructure）二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。为主链构象，不涉及侧链构象。（一）构型与构象构型：立体异构体中取代原子或基团在空间的取向

构象：取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体结构

一个碳原子和四个不同的基团相连时，只可能有两种不同的空间排列，即构型，两种构型的互变需要共价键的断裂；而构象的改变不涉及共价键的断裂，构象可以是无数种，其中交叉型的构象最稳定，重叠型的最不稳定。

（二）肽单元（peptideunit）或肽键平面：

1925年L.Pauling和R.B.Corey等用X线衍射分析肽键的C—N键长时发现其键长为0.132nm，不同于C—N单键键长0.149nm，也不同于C=N双键键长0.127nm，介于二者之间，故其有一定程度的双键性能，C与N不能以C—N为轴心自由旋转。参与肽键的6个原子Cα1、C、O、N、H、Cα2被约束于一个平面上，称为肽键平面，为形成二级结构的基础。（三）二级结构类型

1、蛋白质α螺旋结构(α-helix)PaulingandCorey提出。右手螺旋(顺时针)。肽链的主链形成紧密的螺旋，侧链伸向外侧，每一圈包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距为0.15nm，螺旋上升一圈的距离(螺距)为3.6×0.15=0.54nm。螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽键的NH和第四个肽键的CO形成氢键，第n个肽键的NH和第n+3个肽键的CO形成氢键。蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋（稳定），原因见p.207-208。α螺旋结构形成的限制因素:凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H，不可能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻，则因pH=7.0时都带负电荷，防碍α螺旋的形成；同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内，正电荷相斥，也防碍α螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍α螺旋的形成。2、β—折叠（β-pleatedsheet）

两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻的肽键主链上的-NH和C=O之间形成有规则的氢键，这样的多肽构象就是β-折叠片。在此构象中，所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽键的长轴接近垂直。N端反平行式C端N端β—折叠靠不同肽键之间的肽键上CO与NH形成氢键而得以稳定。反平行式比平行式稳定。平行式N端3、β—转角（β-turn）：

β—折叠反平行式的转折处。第一个残基的C=O与第四个残基的NH形成氢键。脯氨酸和甘氨酸常在这种结构中存在。脯氨酸具有环状结构和固定的φ角，能迫使β转角的形成；甘氨酸缺少侧链，在β转角中能很好地调整其他残基的空间阻碍。4、无规卷曲（randomcoil）：没有确定的规律性。超二级结构若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的组体，这称为超二级结构。有三种基本组合方式：（1）αα：有两股或三股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离约140Å。螺旋链之间是由向着超螺旋内部的非极性侧链相互作用，而极性侧链处于蛋白质分子表面，与水接触。超螺旋的稳定性主要是非极性侧链间的范德华相互作用的结果。（2）βαβ：最简单的βαβ组合是由二段平行式的β-链和一段连接链组成。连接链是α-螺旋或无规则卷曲，大体上反平行于β-链。最常见的βαβ组合是由三段平行式的β-链和二段α-螺旋链构成。连接链都是以右手交叉连接方式处于β-折叠片的一侧。

（3）ββ：有β-曲折和回形拓扑结构二种组合形式。

β-曲折是由一级结构上连续、在β-折叠中相邻的三条反平行式β-链通过紧凑的β-转角连接而成。回形拓扑结构也是反平行式β-折叠片通过紧凑的β-转角连接形成，但构成的是回形结构。模序（motif）：蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有特殊功能的空间结构。如钙结合蛋白中的结合钙离子的模序。α螺旋α螺旋NCCa2+钙结合蛋白中的结合钙离子的模序蛋白质空间构象的正确形成除一级结构为决定因素外，还需要一类称为分子伴侣（chaperon）的蛋白质参加。分子伴侣可防止错误的聚集发生，使肽链正确的折叠；也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣对二硫键的形成起重要作用。四、蛋白质的三级结构（teritarystucture）三级结构:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整条肽链的三维构象。结构域:在蛋白质结构中形成一紧密的结构，具有特殊的功能，多为蛋白质的活性部位。有的蛋白质分子有一个结构域，有的有多个，如纤连蛋白含有6个结构域。维持蛋白质三级结构的主要作用力为侧链间的相互作用:氢键、离子键、疏水键及二硫键。1、氢键如水分子

多肽主链上的羰基氧和酰氨氢之间形成的氢键是维持蛋白质二级结构的主要作用力。

侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成的氢键，参与三级结构。

电负性原子（N、O、S）与氢形成的基团（N-H、O-H）具有很大的偶极距，成键电子云分布偏向负电性大的重原子核，而氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核就在外侧裸露，所以遇到另一个电负性强的原子时，就产生静电吸引，即所谓氢键：

X─H-----YX、Y是负电性强的原子，X─H是共价键，H----Y是氢键，X是氢（质子）供体，Y是氢（质子）受体。2、疏水键

水介质中球状蛋白质总是倾向把疏水残基埋藏在分子的内部，这称疏水相互作用（疏水效应）。疏水相互作用是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。3、离子键是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。在生理pH下，酸性氨基酸（Asp、Glu）的侧链可解离成负离子，碱性氨基酸（Lys、Arg、His）的侧链可解离成正离子。大多数情况下，这些基团分布在球状蛋白分子表面，与介质水分子发生电荷-偶极之间的相互作用形成排列有序的水化层，对稳定蛋白质构象有一定作用(负电荷----H+-OH，正电荷----HO--H+)。4、二硫键是肽链内部或肽链间的半胱氨酸的巯基之间形成的共价键，它对稳定构象起作用。大多数二硫键在β-转角附近形成。5、范德华力包括三种较弱的作用力：（1）定向效应：发生在极性分子或基团之间，是永久偶极间的静电相互作用，氢键属于这种范德华力。(-OH------HO-)（2）诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，是永久偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的相互作用。(-OH-------CH3-)（3）分散效应：为主要的范德华力，是非极性分子或基团间的相互作用。这是瞬时偶极，即偶极方向瞬时变化，是由其所在的分子或基团中电子电荷密度的波动所造成的。

(-CH3-----------CH3-)

范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用。因此，范德华力（吸引力）只有当两个非键原子处于一定距离时才达到最大，这称范德华距离（=两个原子的范德华半径之和）。

蛋白质的三级结构和结构域多肽链在超二级结构的基础上进一步折叠成近乎球状的结构，就是三级结构。结构域：对于较小的蛋白质分子或亚基---其三级结构=结构域；对于由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成的三级结构---------三维实体=结构域。所以，结构域是球状蛋白质的折叠单位。结构域的意义：（1）从结构形成来看，一条长的多肽链先分别折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构在动力学上更为合理；（2）从功能来看，多结构域的蛋白质活性中心往往位于结构域之间，这样容易构建具有特定三维排布的活性中心。结构域之间常有一段肽链相连，形成“铰链区”使结构域容易发生相对运动，有利于别构中心结合调节物和发生别构效应。

五、蛋白质的四级结构（quaternarystructure）（一）四级结构的概念四级结构：亚基的种类和数目、各亚基的空间排布。亚基（subunit）：有的蛋白质分子由两条以上的肽链通过非共价键相连聚合而成，每条多肽链称为一个亚基，即每个三级结构的球状蛋白质。也称单体蛋白质。维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。多体蛋白质（寡聚蛋白质）：由二个或多个亚基组成的蛋白质（如二体蛋白质、四体蛋白质）。对称的寡聚蛋白质：由二个或多个不对称的等同结构（原体）组成。原体一般是一个亚基，也可以是二个或多个原体的聚集体。如：血红蛋白分子由二个原体对称组成，每个原体由一个α亚基和一个β亚基构成（αβ）。这里，如果把原体看作单体，则是二体；如果把亚基看作单体，则是四体。（二）寡聚蛋白质与别构效应1、别构蛋白的结构和效应：别构蛋白质就是调节蛋白质，具有别构效应，即蛋白质与配基结合可改变蛋白质构象，进而改变其生物活性。别构蛋白质都是寡聚蛋白质。分子中每个亚基都有活性部位或者还有别构部位（调节部位）。这样别构蛋白质分子中至少含有二个活性部位或者还有别构部位，各部位之间可通过构象变化传递发生的过程，构象变化可以从一个原体传递给另一个原体，引起协同的相互作用。

同位效应：相互作用的都是活性部位，即一个亚基与配基的结合会影响另一个亚基与配基的结合。如果这种影响是促进作用，则是正协同效应；如果这种影响是降低作用，则是负协同效应。

异位效应：别构部位与活性部位之间的相互影响。2、血红蛋白的结构和功能：血红蛋白由4个亚基组成（α2β2），每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位（p.260，图6-10）。

O2在这里是正协同效应物，血红蛋白的氧合具有正协同效应：一个O2的结合会增加同一血红蛋白分子中其余的氧结合部位对O2的亲和力。（具体参阅p.261-263）。第三节蛋白质结构与功能的关系一、一级结构是空间构象的基础蛋白质的一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。

Anfinsen在研究核糖核酸酶时发现。58658426954011072天然状态β-巯基乙醇尿素SHSH5826_40SHSHSH657284SH95SH110SH84269540110586572天然状态无活性二、蛋白质空间结构与功能的关系（一）肌红蛋白（Myoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特别丰富。是分子量为16700的小分子球状蛋白质，由153个氨基酸残基及一个血红素组成。五十年代，英国科学家JohnKendrew和Perutz用X衍射对抹香鲸肌红蛋白的三级结构研究获得成功，是第一个获得完整构象的蛋白质。它有8段α螺旋结构：A、B、C、D、E、F、G、H。整条肽链折叠成紧密球状分子，疏水侧链大都在分子内部，极性带电荷的则在分子表面，因此水溶性好。1962年Kendrew和Perutz由于测定了肌红蛋白及血红蛋白的高级结构而获Nobel化学奖。Mb分子内部有一个口袋形空穴，血红素居于其中。血红素是血红蛋白及细胞色素等的辅基，具有重要的生理功能。血红素是含铁的卟啉化合物，卟啉由四个吡咯环组成，铁原子位于卟啉环的中央，Fe2+有6个配位键，其中4个和吡咯环的N配位结合，1个与Mb93位（F8）His结合，氧与Fe2+形成第6个配位键，接近64位E7His。（二）血红蛋白(Hemoglobin)血红蛋白（Hb）由四个亚基(珠蛋白)和血红素组成。成人红细胞中主要为HbA1(α2β2)，其中α链141aa，β链146aa，各带有一个血红素与O2结合，所以一分子Hb能与4分子O2结合。不同发育阶段α链相同,β链不同，胎儿期为αγ，胚胎期为αε。Mb与Hb的氧饱和曲线

Hb氧饱和曲线为S形，Mb为直角双曲线。

说明Mb对氧有很强的亲和力。在体内毛细血管中氧分压大于4KPa(30mmHg)，组织中Mb几乎全与O2结合而达到饱和，只有细胞内氧耗很大而使PO2下降到很低时，Mb才释放其中的氧，故组织中的肌红蛋白是很好的储氧物质。Mb的P50=0.13KPa(1mmHg)Mb：Mb与O2结合的直角双曲线提示单个血红素与1个O2结合的一个恒定平衡常数（三）Mb与Hb的氧饱和曲线

Mb为直角双曲线，Hb氧饱和曲线为S形。Hb：Hb与O2结合的S型曲线提示其4个亚基与4个O2结合时平衡常数不同。K1＜K2=K3＜K4协同效应:一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。正协同效应、负协同效应.Perutz等利用X线衍射分析了Hb和氧合Hb的三维结构图谱，解释了正协同效应。未结合O2时，Hb结构紧密，称为紧张态（T态），T态Hb与O2亲和力小；结合O2

后，结构变得相对松弛，称为松弛态（R态）。变构效应（allostericeffect）：一个蛋白质与它的配体或其它蛋白质结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能需要。小分子O2称为变构剂。Bohr效应：1904年ChristianBohr发现Hb与O2的结合也受CO2及pH影响。PCO2升高时，Hb与O2的结合降低，酸性溶液中Hb与O2的亲合力也降低，氧解离曲线右移。故PCO2升高实际上是pH下降影响Hb。pH降低，即溶液中H+浓度升高，使-NH2及咪唑基等质子化，有利于分子内部盐键的形成，使Hb结构趋向紧密，从而降低Hb与O2亲和力，Mb没有四级结构也就没有Bohr效应。Bohr效应使Hb运输O2效率更为提高。肺部呼出CO2，PCO2下降，Hb与O2亲和力加强，利于结合更多氧输入体内。当血液流经组织时，CO2自组织进入血液，PCO2升高，pH下降，Hb与O2亲和力减弱，有利于O2释放入组织。（三）纤维状蛋白质

纤维状蛋白质都是由几条肽链绞合而成，难溶于水，如胶原蛋白、毛发中的角蛋白、弹性蛋白。主要功能是提供坚实的支架，连接各细胞、组织、器官。1、胶原蛋白（Collagen）

组织中胶原蛋白及弹性蛋白含量（占蛋白质总量百分比）氨基酸组成特点：Gly占1/3，脯氨酸和羟脯氨酸占1/5以上，Tyr含量少，Trp、Cys缺乏，为营养不完全氨基酸。氨基酸序列及分型：胶原蛋白α是组成胶原的基本单位。胶原蛋白α又有数种（α1、α2链等），其氨基酸组成不同，但肽链长度近于相同。原胶原（Tropocollogen）：3条α链绞合一起，3条α链可以相同，也可以不同。不同类有胶原由于其α链的氨基酸组成及含糖量不同而性能不同。胶原纤维：电镜下可见原胶原有规律地排列成原纤维。如Ⅰ型原胶原由三条长肽链相互盘绕成右手螺旋，每条长肽链本身为左手螺旋。其稳定与其一级结构密切相关。原胶原的α链一级结构中96%属(Gly—X—Y）n，其中，X常为Pro，Y常为Hyp，在三链超螺旋中，Gly残基在超螺旋内侧，Gly侧链为H，故三链排列紧密。

-13Gly–Pro–Met–Gly–Pro–Ser–Gly–Pro–Arg--22Gly–Leu–Hyp–Gly–Pro–Hyp–Gly–Ala–Hyp--31Gly–Pro–Gln–Gly–Phe–Gln–Gly–Pro–Hyp-除了有范德华引力之外，GlyNH和邻近链CO形成氢键，有赖于大量无侧链的Gly存在于内侧，才能形成紧密的构象。胶原蛋白合成后还受到一系列修饰。如脯氨酸及赖氨酸羟化为羟脯氨酸和羟赖氨酸，羟化反应以Vc为辅因子。

ProPHase4-羟脯氨酸

O2+Fe+抗坏血酸

α-酮戊二酸VcCO2+琥珀酸赖氨酸残基的ε氨基在赖氨酰氧化酶的催化下，可氧化成醛基，此醛基可与邻近的赖氨酸氨基或羟赖氨酸的羟基缩合，形成共价键稳定原纤维的结构。因为羟化酶需要Vc，故Vc缺乏时此类稳定结构的共价键不能形成,以致发生牙龈出血，创伤不易愈合等病变。2、弹性蛋白分布：富有弹性的组织，如肺、大动脉等。初合成时为水溶性单体称为原弹性蛋白。原弹性蛋白从细胞分泌出来后，Lys的εNH2受赖氨酰氧化酶催化而氧化脱氨生成醛基。3个Lys衍生的醛基与1个Lys的εNH2缩合形成十字架样的特殊交联，使弹性蛋白卷曲而具有弹性。交联后极稳定，极难溶解.3、角蛋白毛发、指甲、羽毛为角蛋白。哺乳动物角蛋白为α-角蛋白、鸟类及爬行类为β-角蛋白。α-角蛋白富含半胱氨酸,并与邻近的多肽链交联，形成二硫键，因此α-角蛋白很难溶解，也经受得起一定的拉力。毛料衣服易被蛀掉是由于一类蛾的幼虫消化液中有大量巯基化合物，使二硫键还原成巯基，肽链之间的聚合被解除，肽链被消化。蚕丝蛋白是β折叠富含Gly、Ala、Ser。牢固但不能拉伸。（四）球状蛋白质肌红蛋白（Myoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特别丰富。是分子量为16700的小分子球状蛋白质，由153个氨基酸残基及一个血红素组成。血红素是血红蛋白及细胞色素等的辅基,具有重要的生理功能。血红素是含铁的卟啉化合物，卟啉由四个吡咯环组成，铁原子位于卟啉环的中央。Fe2+有6个配位键，其中4个和吡咯环的N配位结合，1个与Mb93位（F8）His结合，氧与Fe2+形成第6个配位键，接近64位E7His。五十年代，JohnKendrew用X衍射对抹香鲸肌红蛋白的三级结构研究获得成功，是第一个获得完整构象的蛋白质。它有8段α螺旋结构,A、B、C、D、E、F、G、H。整条肽链折叠成紧密球状分子，疏水侧链大都在分子内部，极性带电荷的则在分子表面，因此水溶性好。第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质的相对分子质量1、根据化学组成测定相对分子量用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并根据蛋白质分子中含有的微量元素数，可计算出蛋白质的最低相对分子质量。

铁的原子量55.8×100=铁的百分含量0.335最低相对分子质量==16700肌红蛋白含铁量为0.335%。2、渗透压法测定相对分子量当用一种半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开时，只有水分子能自由地通过半透膜进入蛋白质溶液，而蛋白质分子却不能透过进入纯水中。由于渗透的结果，溶液内体积增加，液面升高，直至达到一定的净水压力时维持平衡。这时的净水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压。Π=nRT/V=（g/Mr）RT/V=cRT/MrΠ：渗透压；V：溶液体积；n：溶液中溶质的摩尔数；g：溶质的质量；c：溶质的浓度；T：绝对温度；R：气体常数；Mr：溶质的相对分子质量？为什么要在蛋白质分子处于等电点时测定渗透压3、蛋白质的扩散和扩散系数

把纯水小心地放在蛋白质溶液上面，蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的低浓度区迁移，直至达到平衡，既蛋白质均匀地分布在整个溶剂系统中。由于浓度差引起的这种溶质分子的净迁移为扩散。溶质的扩散系数可由下式计算：C2C1e-X22-X214Dt=即测定两个不同部位的浓度，就可计算扩散系数D。？为什么在用扩散系数确定蛋白质相对分子质量时，需要与沉降系数结合来确定4、沉降分析法测定相对分子质量

蛋白质分子在溶液中受到强大离心力作用时，蛋白质分子会沉降。沉降的速率与蛋白质分子大小、密度、分子形状以及溶液的密度和粘度有关。1、沉降速率法蛋白质样品溶液在离心力作用下，产生沉降界面。可通过界面移动的速率计算沉降系数，并计算蛋白质相对分子质量。2、沉降平衡法在离心力作用下，蛋白质颗粒发生沉降。由于沉降的结果造成浓度梯度，因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向与离心力相反。可通过测定扩散速率，计算出蛋白质相对分子质量。5、凝胶过滤法测定相对分子质量

通过凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。

蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯托克半径。某种蛋白质如果与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径。测定方法：首先侧得几种相对分子质量已知的蛋白质标准物的过柱速度，并以其相对分子质量的对数与过柱速度作标准直线图，然后测出蛋白质样品的过柱速度，即可从标准直线图中确定样品的相对分子质量。5、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量

蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率决定于其所带的净电荷、分子大小和形状等。如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质迁移率主要取决于其相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。

SDS是一种有效变性剂，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，而巯基乙醇能破坏二硫键，因此在二者作用下，单体蛋白质或亚基处于展开状态，SDS与蛋白质分子结合成复合体。复合体的形成造成了2种结果：1、不同蛋白质被阴离子SDS覆盖而具有相同密度的负电荷；2、不同蛋白质单体分子由于SDS结合而具有统一的直径，但长度随蛋白质相对分子质量成正比变化。聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，使得电泳迁移率与多肽链分子量有如下关系：

LogMr=K1–K2（样品迁移距离/前沿迁移距离）由于蛋白质分子上除了肽链两端有自由的α-NH2和α-COOH外，在侧链上还有很多解离基团（ε-NH2、γ-COOH、β-COOH、咪唑基、胍基（精氨酸）），在一定的pH条件下都能解离成带电基团，而使蛋白质带电。二、两性电离及等电点等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。H2O+PCOO-NH2H+OH_PNH3+COO-PNH3+COOHH+OH-pH

＞pIpH＜pIpH=pI酸性氨基酸pI＜7，碱性氨基酸pI＞7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性aa较多，其pI偏碱，如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多，其pI约为12；若含酸性aa较多，则pI偏酸。蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。蛋白质等电点性质为电泳分离的依据.三、胶体性质蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；同时，蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。四、蛋白质的沉淀作用如果使蛋白质成为胶体的稳定条件发生变化，就很容易使蛋白质变得不稳定而发生沉淀现象。

这种稳定条件变化方法有：（1）在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷。如无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，中和电荷作用）、有机溶剂（乙醇、丙酮等，破坏水膜作用）；（2）调节溶液的pH值，使达到蛋白质的等电点而失去电荷；（3）加热法（失去活性）；（4）重金属盐（汞、银、铜盐等）、磷钨酸、三氯醋酸和生物碱等沉淀剂可使蛋白质沉淀（失去活性）。五、蛋白质变性（denaturation）在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的非共价键断裂，天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。蛋白质变性后其溶解度降低，粘度增加，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。变性蛋白质不一定都沉降，沉降出的蛋白质也不一定变性。造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢复活性。六、蛋白质的紫外吸收

Trp、Tyr在280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质定量测定七、蛋白质的呈色反应（1）茚三酮反应（ninhydrinreaction）。（2）双缩脲反应（biuretreaction）。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。第五节蛋白质的分离与纯化一、蛋白质的抽提原理与方法原理

大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。所以，分子结