感染性疾病免疫学检测

感染性疾病免疫学检测蚌医一附院检验科朱安友2/6/20231什么是感染性疾病?感染性疾病不一定会传染，而传染病一定是感染性疾病一部分疾病可以通过各种方式，如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人体间传播，具有较强的传染性，对社会危害极大，这一类疾病被归于传染病范畴。感染性疾病传染病非传染病是由各种病原体，如病毒、细菌、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫等引起的疾病。2/6/20232感染免疫感染致病病原体对机体的感染非特异性免疫特异性免疫机体的抗感染免疫作用？2/6/20233特异性免疫抗体感染免疫2/6/20234人体内的5种抗体H链：,,,,.(Alpha)(Gamma)(Mu)(Delte)(Epsilon)

Ig种类IgA,IgG,IgM,IgD,IgE2/6/20235免疫球蛋白的水解片段2/6/20236免疫学检测技术基本原理基于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点利用已知

Ag

未知

Ab利用已知

Ab未知

Ag检测检测Ag+AbAg-Ab2/6/20237免疫学检测技术的类型荧光标记技术放射免疫标记技术酶免疫技术胶体金免疫技术化学发光免疫分析电化学发光免疫分析免疫标记技术经典血清学技术凝集反应沉淀反应补体结合反应中和反应2/6/20238要保证检验结果的正确性和可靠性，必须对实验的检测原理及整个过程中各个环节的干扰因素，有比较清楚的掌握和了解。

了解这些干扰因素，对于我们在临床工作中如何注意和解决这些干扰，以及实验结果的解释具有重要意义。2/6/20239常用检测项目乙肝两对半检测梅毒螺旋体抗体检测HCV抗体检测HIV抗体检测2/6/202310一、乙肝两对半检测项目

HBsAg

HBsAb

HBeAg

HBeAb

HBcAb检测技术ELISA

化学发光

时间分辨荧光

免疫层析检测方法

夹心法

竞争法检测结果

定性

定量2/6/202311

双抗体夹心法模式：固相载体AbAg标记Ab(一)、HBsAg双抗体夹心法：两步法，一步法2/6/202312HBsAg抗原表位1、共同决定簇：a（aa124-147）；2、型特异决定簇：（1）d/y（aa122，赖氨酸/精氨酸）；（2）w/r（aa160，赖氨酸/精氨酸）；

四种亚型：adr、adw、ayr、ayw。

(一)、HBsAg2/6/202313检测中常见的问题1、一步法测定中的钩状效应（Hookeffect）：

一步法检测时，受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合，而不能形成“固相抗体—抗原—标记抗体”夹心复合物，所得结果将低于实际的含量，这种现象称为钩状效应。钩状效应严重时，可出现假阴性结果。(一)、HBsAg2/6/202314双抗体夹心一步法的钩状效应固相载体固相AbAg标记Ab(一)、HBsAg2/6/202315钩状效应是HBsAg一步法检测时不可避免的现象；由于钩状效应的存在，一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性；解决钩状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原，再加标记抗体的两步法检测：第一步：包被抗体捕获抗原成为固相，然后分离游离抗原；第二步：固相抗原与标记抗体结合，分离液相标记抗体后记录检测信号。(一)、HBsAg2/6/202316两步法检测能消除钩状效应：固相载体AbAg标记Ab(一)、HBsAg2/6/2023172、人抗鼠抗体效应(Humananti-mouseeffect,HAMA效应)对检测的干扰产生HAMA的原因：经常接触老鼠；肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。

用鼠源McAb检测HBsAg时，如样品中有HAMA，就会产生假阳性或假阴性。

非鼠源的PcAb可消除HAMA效应。(一)、HBsAg2/6/202318HAMA效应的假阳性模式：标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAbMcAb结合，形成固相HBsAb－HAMA－HBsAb复合物。固相载体固相McAb标记McAb人抗鼠抗体(一)、HBsAg2/6/2023193、S基因突变引起的HBsAg漏检：基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg蛋白质氨基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。变异率高，自然变异和免疫逃避，变异无地域性。HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型HBsAb所识别。

不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变，同样可以检出。(一)、HBsAg2/6/202320

固相载体HBsAgMcAb（“a”）HBsAgMcAb（“a”）标记McAb（抗“d”）标记PcAb（抗“r”）4、PcAb检测HBsAg（adr）的灵敏度高于McAb标记PcAb（抗“d”）HBsAg标记McAb（抗“d”）(一)、HBsAg2/6/2023215、标本自身及前处理引起的干扰因素(一)、HBsAg类风湿因子嗜异性抗体自身抗体补体纤维蛋白溶血或黄疸交叉反应性物质外源性物质(污染、抗生素和生物制剂等）2/6/2023226、操作不当或人为等外在因素(一)、HBsAg标本编号、加样或加试剂差错孵育洗板结果判读和报告失误等2/6/202323ELISA检测模式：一步法。原材料：McAb；检测结果：定性。缺点：钩状效应，灵敏度较差，HAMA干扰、RF干扰，不能定量。化学发光（某些公司）检测模式：一步法。原材料：McAb；检测结果：定量。灵敏度好于ELISA，无RF干扰。缺点：钩状效应，HAMA干扰，定量结果不能溯源到国际标准。(一)、HBsAg常见HBsAg检测情况：2/6/202324Abbott公司检测模式：两步法。原材料：McAb(固相），PcAb（Fab，标记抗体）；检测结果：定量。优点：1）无钩状效应；2）无HAMA、无RF干扰；3）灵敏度高；4）加用了针对不同突变株病毒抗原的检测抗体，可以进行HBsAg突变株的检测；5）定量结果可溯源到国际标准。(一)、HBsAg2/6/202325时间分辨荧光检测模式：两步法。原材料：McAb(固相），PcAb（标记抗体）；检测结果：定量。特点：无钩状效应；灵敏度高；无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测,可能有RF干扰，定量结果不能溯源到国际标准。(一)、HBsAg2/6/202326目前国际上常用的HBsAg标准物质：德国兰根埃尔利希研究所（PaulEhrlichInstitute）参考物:PEI/ml;法国参考物：ng/ml;雅培参考物：ng/ml（Axsym),IU/ml(i2000)；NIBSC参考物（WHO)：IU/ml.（英国国家生物标准与检定所，NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,NIBSC)1IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml(一)、HBsAg2/6/202327原材料：HBsAg1、天然HBsAg：血源的纯HBsAg，即S蛋白（小球形颗粒）；HBsAg小球型颗粒（20~22nm）

Dane颗粒（40~42nm)管型颗粒

(二)、HBsAb2/6/202328rHBsAg球型颗粒28~30nm2、基因工程重组抗原（rHBsAg)(二)、HBsAb2/6/202329HBsAb为分别针对HBsAg五种表位（a、d/y、w/r）的不同抗体，其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体，为最重要的保护性体，对不同亚型感染均有保护作用（但交叉免疫不完全），也是HBsAb各种抗体中最重要的血清标志物。用于检测HBsAb的抗原，无论天然抗原或重组抗原，必须具有“a”表位，一般为ad、ay亚性联合应用。目前HBsAb试剂原材料质量优良，检测方法为双抗原夹心法，定量定性检测的结果较准确可靠。(二)、HBsAb2/6/202330HBsAg阳性+HBsAb阳性模式讨论在HBV感染及机体免疫过程中，可能有HBsAg和HBsAb同时存在的短暂过程，但很难出现在检测过程中：HBsAg过剩时，HBsAb与其结合，以抗原抗体复合物形势存在，血中测不到游离抗体。HBsAb过剩时，HBsAg以抗原抗体复合物形势存在，血中测不到游离抗原。由于抗原抗体反应是可逆的，在检测灵敏度大幅提高的情况下，上述情况不能绝对化。(二)、HBsAb2/6/202331HBsAg阳性+HBsAb阳性模式讨论部分HBV的S基因突变引起“a”决定簇氨基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化，野生株抗HBs不能将其清除。不同亚型HBV感染。两株不同亚型HBV感染及机体免疫过程：1、两株不同亚型HBV同时或先后感染同一个体，合成两种不同亚型的HBsAg1和HBsAg2；2、前者刺激机体产生HBsAb1，后者未刺激机体产生HBsAb2；3、HBsAb1中和了相应的HBsAg1而不能中和HBsAg2,HBsAg2与HBsAb1同时存在。(二)、HBsAb2/6/202332常见HBsAb检测情况：ELISA原材料：天然抗原。检测模式：一步法。检测结果：定性，半定量。缺点：可能出现假阳性，定量结果干扰因素较多。化学发光原材料：天然抗原。检测结果：定量。检测模式：一步法。(二)、HBsAb2/6/202333Abbott原材料：重组抗原。检测模式：两步法。检测结果：定量。时间分辨荧光原材料：天然抗原。检测模式：两步法。检测结果：定量。(二)、HBsAb2/6/202334检测方法和影响因素类似于HBsAg(三)、HBeAg2/6/202335方法：竞争法。原材料：1）McAbHBeAb;2）rHBeAg。存在问题：原材料：大肠杆菌表达的基因工程抗原(rHBeAg/E.coli)：优点：稳定性好，使用安全，价格低廉。缺点：特异性差。1、HBeAg和HBcAg是基因同源性很高的两种抗原，但具有完全不同的抗体结合表位，与HBcAg间存在明显的交叉抗原性；2、菌体杂质干扰检测。很多人感染过大肠杆菌，血清中的抗大肠杆菌抗体能与重组抗原中的成分结合。(四)、HBeAb2/6/202336由于检测抗原特异性差，不能采用双抗原夹心法、间接法、捕获法等反应模式。固相载体HBeAg/E.coliHBcAb标记HBeAg/E.coliAg/E.coli抗E.coli抗体标记Ag/E.coli夹心法时的假阳性结果固相载体HBeAg/E.coliHBcAb标记抗人IgGAg/E.coli抗E.coli抗体标记抗人IgG间接法时的假阳性结果(四)、HBeAb2/6/202337解决办法：采用HBeAbMcAb，用竞争法检测HBeAb，避免样本中HBcAb及抗大肠杆菌抗体的干扰：固相载体rHBeAgHBcAb标记HBeAb抗E.coliAg/E.coli阴性结果2/6/202338固相载体rHBeAgHBeAb（标本）标记HBeAb阳性结果(四)、HBeAb-检测模式11）液相-液相竞争法（一步法）检测HBeAb2/6/202339固相载体rHBeAg酶标HBeAb阴性结果1）液相-液相竞争法（一步法）检测HBeAb(四)、HBeAb-检测模式12/6/202340液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结果的干扰固相载体HBeAg(标本）rHBeAg标记HBeAb2/6/202341固相载体HBeAg(标本）rHBeAg标记抗体假阳性结果液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结果的干扰2/6/202342固相载体HBeAbHBeAb（标本）标记HBeAbrHBeAg中和试剂阳性结果2）固相-液相-液相竞争法(四)、HBeAb-检测模式22/6/202343固相载体HBeAb标记HBeAbrHBeAg中和试剂阴性结果2）固相-液相-液相竞争法(四)、HBeAb-检测模式22/6/202344固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰固相载体HBeAb（包被）HBeAg(标本）rHBeAg中和试剂标记抗体2/6/202345固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰固相载体HBeAb（包被）HBeAg(标本）rHBeAg中和试剂标记抗体假阳性结果2/6/202346

固相-液相竞争法（两步法）检测HBeAb时，避免了标本中的HBeAg及检测抗原对检测结果的干扰固相载体HBeAb（包被）HBeAg(标本）rHBeAg中和试剂标记抗体阴性结果2/6/202347高浓度HBeAg可能导致（+-+-+）（+--++）高浓度HBeAg在一步法检测中会出现假阴性，也会导致液相－液相竞争法及固相－液相－液相竞争法检测HBeAb时的假阳性，二者是有因果关系的两项误差。由于HBsAg/HBeAg阳性与HBsAg/HBeAb阳性两者均是常见的血清学检测模式，上述误差不易引起重视。两种模式所提示的临床意义完全不同。一步法试剂在检测高浓度HBeAg标本时，可能提供了虚假的HBeAg血清转换的病情信息，对临床医生产生了误导。(四)、HBeAb2/6/202348常见HBeAb检测情况：ELISA检测模式：一步法：1、液相-液相竞争法；2、固相-液相-液相竞争法。如标本中含HBeAg时，明显干扰检测结果，浓度高时易出现假阳性。Abbott化学发光检测模式：固相-液相竞争法(两步法)。避免中和试剂rHBeAg和标本中HBeAg对标记抗体HBeAb的中和作用，也避免了由此引起的假阳性结果。(四)、HBeAb2/6/202349方法：竞争法(液相-液相竞争法、固相-液相竞争法)。由于血清中不存在HBcAg，反应模式的选择对结果影响不大；阳性检出率与标本的稀释倍数关系密切；HBcAg免疫原性强，刺激机体产生HBcAb的时间早，滴度高，持续时间长。有文献报到HBV感染者可表现为HBcAb单项阳性。但一般认为其临床诊断价值不如HBsAg、HBeAg及HBVDNA。(五)、HBcAb2/6/202350固相载体HBcAgHBcAb（标本）标记HBcAb阳性结果液相-液相竞争法（一步法）检测HBcAb(五)、HBcAb2/6/202351固相载体HBcAg酶标HBcAb阴性结果液相-液相竞争法（一步法）检测HBcAb(五)、HBcAb2/6/202352固相载体HBcAgHBcAb（标本）阳性结果(五)、HBcAb-不公平竞争标本和酶标抗体加入时间的不同步性，导致的不公平竞争，能引起检测结果的阳性率增加。一定时间后加入酶标HBcAb2/6/202353常见模式少见模式罕见模式对于少见和罕见模式应仔细复查后，慎重报告两对半结果模式2/6/202354两类方法(1)非特异性梅毒抗体试验(2)特异性梅毒抗体问题：为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法？二、梅毒血清学检测2/6/202355梅毒螺旋体一旦感染人体，可刺激机体产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体-反应素）。（抗原可能为TP损害患者组织释放出的物质或TP本身的脂质成分）未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。问题：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需要做定性和定量两种检测方法？非特异性梅毒抗体试验2/6/202356方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)

（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似非特异性梅毒抗体试验2/6/2023571、仪器：水平旋转仪，转速、转幅2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，

并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：水平旋转仪旋转8分钟(23℃-29℃）

，亮光下观察结果100r/min约18mm非特异性梅毒抗体试验操作要点2/6/2023583、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性试验。1:11:21:41:81:161:321:641:2561:1281:512定量试验结果判断血清稀释度结果1:11:21:41:81:16+----1:1++---1:2++++-1:8非特异性梅毒抗体试验操作要点2/6/202359早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后一期梅毒1年后转为阴性二期梅毒2年后转为阴性。晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。非特异性梅毒螺旋体抗体试验临床意义2/6/202360假阳性反应技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。非特异性梅毒螺旋体抗体血清学假阳性2/6/202361抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题：梅毒螺旋体特异性抗体定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？梅毒螺旋体特异性抗体血清学试验2/6/202362梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）梅毒螺旋体特异性抗体血清学试验2/6/202363TPPATPPA试验用梅毒螺旋体抗原致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。梅毒螺旋体特异性抗体血清学试验2/6/202364ELISA/CLIAELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。本法可用于大样本血清检测。化学发光法的临床应用意义基本同ELISA化学发光法的敏感性？？梅毒螺旋体特异性抗体血清学试验2/6/202365梅毒免疫层析快速检测梅毒螺旋体特异性抗体血清学试验2/6/202366作为非梅毒螺旋体特异性抗体试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验，排除RPR假阳性。不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。TPPA等梅毒螺旋体抗原血清试验不能作为疗效观察的指标。梅毒螺旋体特异性抗体试验临床意义2/6/20236768非梅毒螺旋体特异性抗体试验梅毒螺旋体特异性抗体试验排除试验假阳性确证梅毒螺旋体现症感染排除治愈的既往感染者确证梅毒螺旋体现症感染RPR：初筛试验TPPA：确证试验梅毒实验室检测策略思考2/6/202368规范化梅毒实验室检测要求根据目的选择检测方法及检测策略。可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。2/6/202369非梅毒螺旋体特异性抗体试验梅毒螺旋体特异性抗体试验2/6/20237071阳性

梅毒螺旋体血清试验

（ELISA）

阴性

报告：

ELISA阴性

阳性

RPR定性/定量试验

阴性

推荐TPPA复检

阳性

报告：

ELISA阳性

RPR阳性及滴度

阴性

报告：

ELISA阳性

TPPA阳性

RPR阴性

报告：

ELISA阳性

TPPA阴性

RPR阴性

报告：

ELISA阳性

RPR阴性

梅毒螺旋体特异性抗体试验2/6/202371三、HCV感染的血清学检测二○一○年五月二十日

2/6/202372HCV的血清学检测2/6/202373HCV抗体假阴性问题HCV-RNA检测更敏感，1~2周间接法检测抗-HCV抗体2/6/202374HCV血液筛查检测流程2/6/202375HCV临床诊断筛查的检测流程做补充实验或建议进一步做补充实验2/6/202376HCV临床诊断补充试验检测流程（1）2/6/202377HCV临床诊断补充试验检测流程（2）2/6/202378HCV临床诊断补充试验检测流程（3）2/6/202379HCV检测结果解释2/6/202380酶联免疫吸附法（ELISA）：

第三代试剂：双抗原夹心法检测抗体(目前普遍采用）第四代试剂：检测抗体和HIV-1p24抗原快速方法：金标法化学发光法蛋白免疫印迹试验（WB）筛查试验确证试验四、HIV抗体检测2/6/202381什么是艾滋病窗口期？艾滋病病毒进入人体后，需要经过一段时间人体才会产生艾滋病毒抗体，或人体已产生艾滋病毒抗体，但血液中抗体量少尚无法测出。在此期间抗体检测呈阴性，这段时间即为“窗口期”。如何计算窗口期？应从高危行为之时或是接受输血之时起，至最初HIV抗体检测呈阳性的时间2/6/202382“窗口期”带来的我到底有没有得艾滋病？……困惑？2/6/202383哪些因素影响HIV“窗口期”时间？人体对艾滋病毒的免疫应答：一般5天至9天，或1周至2周机体可产生抗体。检测方法和试剂：灵敏度越高，窗口期越短2/6/202384<concentration=>4th代3rd代=>

=>1st-2nd代HIV抗原IgM抗体IgG抗体检测线<=窗口期ELISA试剂与HIV“窗口期”2周3周12周目前普遍采用的第三代酶免试剂HIV窗口期一般不超过6周2/6/202385缩短1周检测方法和试剂比较化学发光法核酸检测延长1周ELISA缩短数天2/6/202386HIV抗体检测程序样品初筛试验筛查试剂阳性反应阴性反应复检试验均阳性反应一阴一阳均阴性反应确证试验报告阴性原有试剂+另一不同原理或厂家初筛试剂HIV抗体阴性HIV抗体阳性HIV抗体不确定筛查实验室确证实验室2/6/202387筛查试验呈阴性反应，可直接出具HIV抗体阴性报告HIV初筛检测结果的报告和处理筛查试验阴性（－）2/6/202388筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。并进行以下处理筛查试验阳性（+）（1）