研究生课程-细胞培养与应用

细胞培养与应用第一部分动物细胞培养技术BioengineeringCollegeDalianUniversity定义：指将动物的某一组织取出，使其分散成单个细胞，在人工模拟体内生理环境的条件下使之存活、生长和增殖的技术。动物细胞培养BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞培养可分为原代培养和传代培养原代培养：又称初代培养。指将机体取出的细胞或组织置于体外条件下生长，直到第一次传代之前的过程。大约能增殖10代左右。传代培养：也称继代培养。指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中继续培养。BioengineeringCollegeDalianUniversity原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞系与细胞株的概念细胞系（cellline）：原代培养的细胞已经首次传代成功即成为细胞系，细胞系可泛指一般可传代的细胞。有限细胞系和无限细胞系：不能传代或传代次数有限，称有限细胞；大多数二倍体细胞为有限细胞系。能连续传代的细胞系，称永久细胞系。细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞体外培养的生长方式1.贴壁型细胞

(1)成纤维细胞型细胞

(2)上皮细胞型细胞

(3)游走型细胞

(4)多形型细胞2.

悬浮型细胞BioengineeringCollegeDalianUniversity1.动物细胞的分裂周期长：

动物细胞分裂周期一般为12-48h。它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如：温度、pH、培养基成分等也会影响分裂周期的长短。动物细胞体外培养特点BioengineeringCollegeDalianUniversity各类细胞分裂周期时间表BioengineeringCollegeDalianUniversity2.贴附生长并伸展：

贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点。它受许多因素影响，如离子浓度、机械、物理因素、生物因素等。动物细胞体外培养特点BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞贴壁后的伸展BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞体外培养特点3.接触抑制(contactinhibitition)

现象：

贴壁生长的细胞分裂增殖，细胞间逐渐汇合相互接触时，细胞停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称为接触抑制或密度依赖抑制现象。BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞体外培养特点4.有限细胞系和永久细胞系

原代培养细胞经继代培养后即成为有限细胞系只能在有限的时间内生存，经过10-50代后细胞逐渐死亡。细胞继代次数和存活时间的长短以细胞来源的年龄和种属不同而有差异。年龄越大继代次数越少。BioengineeringCollegeDalianUniversity

有限细胞系转化成永久细胞系称为“体外转化”。永久细胞系有如下特征：细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加；细胞接种到体内后，生癌率上升。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.动物细胞的环境敏感性

动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。因此对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。动物细胞体外培养特点BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞体外培养的条件1.温度:37℃对低温耐受比对高温耐受强2.pH7.2-7.4对偏酸性耐受强些3.气体O2和CO2（5%)CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-4.营养需求：培养基和血清5.渗透压6.无污染：培养要严格在无菌条件下进行，细菌、真菌、病毒、或其它细胞均可导致培养物的污染。BioengineeringCollegeDalianUniversity实验室BioengineeringCollegeDalianUniversity常用实验用品、设备1.水处理设备：蒸馏水发生器、超纯水系统2.无菌设备：超净台、灭菌锅、滤器等3.培养设备：CO2培养箱4.观察分析设备：显微镜、酶标仪等5.分离与保存设备：离心机、低温冰箱、液氮罐6.耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，冻存管等BioengineeringCollegeDalianUniversity自动双重纯水蒸馏器纯水仪水处理设备BioengineeringCollegeDalianUniversity常用灭菌器具：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒压力蒸汽消毒器（灭菌锅）：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒。滤器：过滤除菌无菌设备BioengineeringCollegeDalianUniversity超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。BioengineeringCollegeDalianUniversity高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌：121℃,20min全过程约2h。BioengineeringCollegeDalianUniversity电热干燥箱——可用于器材烘干以及进行干热灭菌。干热灭菌（140℃，2-3h）烘干70℃BioengineeringCollegeDalianUniversity滤器BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity设定条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③蒸馏水槽中灭菌蒸馏水3000毫升以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。CO2

培养箱BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity酶标仪微孔板震荡器BioengineeringCollegeDalianUniversity天平酸度计BioengineeringCollegeDalianUniversity培养瓶BioengineeringCollegeDalianUniversity培养板BioengineeringCollegeDalianUniversity冻存管BioengineeringCollegeDalianUniversity刻度吸管和电动移液器BioengineeringCollegeDalianUniversity实验室动物细胞培养的一般过程

动物细胞小规模培养方法有：培养瓶培养法、培养板培养法、培养皿培养法。

准备工作：

1.器材的清洗、包装和灭菌

2.培养液及其他培养用液的配置BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞培养

原代培养：

组织块培养法——用剪刀将组织剪成小块组织消化培养——用酶液将组织小块进一步分散成细胞团或单个细胞传代培养——细胞覆盖80%-90%是传代的最佳时期

BioengineeringCollegeDalianUniversity组织块培养法BioengineeringCollegeDalianUniversity组织消化培养取材分离组织消化（胰蛋白酶、胶原酶）培养过程BioengineeringCollegeDalianUniversity传代培养BioengineeringCollegeDalianUniversity动物细胞贴壁培养的生长阶段游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）BioengineeringCollegeDalianUniversity游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态；也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。一般游离期持续10分钟——4小时BioengineeringCollegeDalianUniversity贴壁期：

细胞附着于底物上，游离期结束。贴壁表面要带阳性电荷和高度的表面活性；一般用于细胞培养的表面是玻璃、塑料、金属和微载体。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。血清中有促使细胞贴壁的带正电荷的糖蛋白（生长基质），这些促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着于吸附的促贴壁因子。BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞贴壁过程BioengineeringCollegeDalianUniversity潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。

培养细胞的活力测定BioengineeringCollegeDalianUniversity台盼蓝法测细胞活力

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞冻存和复苏1.冻存和复苏的原则：慢冻快融2.在细胞冻存时加入低温保护剂能大大提高冻存效果。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。获得较好的冻存效果的方法：BioengineeringCollegeDalianUniversity1.预先配制冻存液：含20%血清培养基、10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106-5×106细胞/mL)3.1mL/管分装于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4.1年后，存活率可达80％一90％。细胞冻存方法DMSO液先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。BioengineeringCollegeDalianUniversityl.从液氮中取出冷冻管，迅速投入38～40℃水浴中，1分钟以内使其融化；2.于5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；3.低速离心10分钟；4.去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞复苏方法第二部分动物细胞应用

BioengineeringCollegeDalianUniversity

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝原理：MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。细胞增殖及细胞毒性检测细胞毒性检测细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析BioengineeringCollegeDalianUniversity细胞凋亡与坏死检测采用Hoechst33342和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)双染的方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity免疫化学检测法利用免疫学抗原抗体反应的灵敏性，以荧光素、酶、放射性核素或电子致密物质等对抗原或抗体加以标记，对某些蛋白质(抗原或抗体)进行检测的技术。特点：敏感性高、特异性强、应用范围广，可以对蛋白质进行定量、定性或定位。常用的免疫化学检测法：免疫荧光技术酶联免疫吸附Westernblot技术2023/2/5572023/2/558免疫荧光技术5μm2023/2/560Westernblot杂交细心责任心爱心BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity

沿固相表面单层贴壁生长，直至长满表面。表面长满后不再生长，需进行传代。一般采用酶消化法或机械法使细胞从生长表面上脱落下来。贴壁型细胞BioengineeringCollegeDalianUniversity贴壁型细胞

外形与体内成纤维细胞形状相似，大致呈梭形或成纤维细胞型细胞

起源于中胚层的细胞（比如心肌、平滑肌、成骨肌细胞）在体外培养时一般表现为这种形式。

不规则三角形。中央有圆形细胞核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起突连成网，生长时呈放射状、漩涡状走向。BioengineeringCollegeDalianUniversity贴壁型细胞上皮细胞型细胞

细胞呈不规则扁平多角形，中间有扁圆形胞核，彼此紧密相连的成单层生长。消化道上皮、肝、胰和肺泡上皮等起源于外胚层和内胚层的细胞在体外培养生长时多呈上皮细胞型。BioengineeringCollegeDalianUniversity贴壁型细胞游走型细胞

细胞贴附于支持物上分散生长，一般不连接成片；常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。该类细胞主要是单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity贴壁型细胞多形型细胞

形态上不规则，由胞体和胞突两部分组成，胞突呈细长型，类似丝状伪足。最常见的多形型细胞是神经元和神经胶质细胞。BioengineeringCollegeDalianUniversity悬浮型细胞非贴附型细胞

此类细胞体外生长不必贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞、转化细胞系都属于此类细胞。形态学特点是胞体始终为球形。BioengineeringCollegeDalianUniversity兼性贴壁型细胞

动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、小鼠L929细胞等。BioengineeringCollegeDalianUniversity

1.天然培养基：

天然培养基有血清、血浆和组织提取液。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。BioengineeringCollegeDalianUniversity2.合成培养基

合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。目前已设计出许多种培养基，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点:标准化生产，成分相对固定,成本低缺点:只能维持生存，需要额外补充血清。

BioengineeringCollegeDalianUniversity血清

成分复杂，提供维持细胞生长增殖的各种生长因子和保持细胞生物学性状所需的许多未知成分。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清包括小牛血清和胎牛血清。胎牛血清来源少，价格高。小牛血清要求刚生下未哺乳的小牛。优质血清：透明，淡黄色，无沉淀物，无污染。一般使用浓度10%，冻存细胞时用20%。BioengineeringCollegeDalianUniversity血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．BioengineeringCollegeDalianUniversity培养基3.无血清培养基通过在基础培养基中补充已知的一些细胞生长因子代替血清，比如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。BioengineeringCollegeDalianUniversity常用各材质器材、器皿的准备1.玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗2.橡胶制品：浸泡、2%NaOH煮、自来水冲洗、1%盐酸浸泡、蒸馏水煮沸3.塑料制品：自来水冲洗、2%NaOH浸泡、自来水、5%盐酸浸泡、冲洗4.金属器具：擦拭、消毒烘干、包装、湿热或干热灭菌BackBioengineeringCollegeDalianUniversity清洁液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity1.水：新鲜制备的三蒸水或去离子水2.平衡盐缓冲液：常用有Hank’s液、Earl液和PBS等

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20g

加水至1000ml细胞培养用液的配制BioengineeringCollegeDalianUniversity

3.消化液：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA溶液常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用无Ca2+、Mg2+的缓冲液配制；用滤器过滤除菌。消化时间2-10分钟,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。用于传代细胞消化时常和EDTA联合使用。胶原酶对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织。作用温和，长时间作用也不会影响细胞，血清和钙、镁离子对其无影响。BioengineeringCollegeDalianUniversity

4.培养基：

合成培养基大多数都已商品化，如DMEM、RPMI-1640、MEM等。一般为粉末状，按每袋可配置1L培养基的量分装。配制时，一袋粉末溶于1L三蒸水中，加入2gNaHCO3，用0.22μm的滤膜抽滤灭菌；分装后于4℃短期保存，尽快用完。完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5