生物信息学PCR引物设计

常规PCR引物设计实例分析武汉东湖学院生命科学与化学学院涂毅主要内容一、PCR及引物设计的一般原则二、常用的引物设计软件三、引物设计流程四、实例分析五、使用Primer–BLAST工具快速设计引物一、PCR及引物设计的一般原则聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR引物设计引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败，表现为：扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素一般原则1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点.Tm值的计算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

对于长一些的引物可用更为准确的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

一般原则3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%一般原则5.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（能值越高越容易结合）一般原则6.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。

二、常用的引物设计软件Oligo7（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer-BLAST（在线服务）*三、引物设计流程序列查找和下载序列同源性比较引物设计与筛选引物加工与修饰引物评价分析引物二次筛选引物最终评估扩增基因：BPMVRNA2链上的CP基因片段。实验目的：根据RNA2中的CP基因序列的保守区域设计特异性引物，然后进行PCR实验，以此来检测BPMV在样品材料中的存在情况。四、

实例分析研究背景：菜豆荚斑驳病毒（BPMV）

具有大小分别为41kDa和22kDa的两种外壳蛋白（coatprotein，cp），由RNA2链编码，CP基因序列相对保守，可对此进行PCR扩增来检测BPMV。☆酶联免疫方法检测的是表面指标，只能提供间接证据，而PCR技术直接检测的是核酸，适用于病毒密度很低的临床标本检测软件资源BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)站点:

/BLAST/PrimerPrimier、Oligo下载：

/q2.htmlDNAMAN下载/?Go=Show::List&ID=125704.1在NCBI上查找BPMV的相关序列4.2BLAST同源序列（相似性序列）查找登陆ncbi的blast主页搜索核苷酸数据库使用核苷酸查询搜索蛋白质数据库用蛋白查询搜索蛋白质数据库，使用一个翻译的核苷酸查询搜索翻译的核苷酸数据库使用的一种蛋白质查询搜索翻译核苷酸数据库，使用一个翻译的核苷酸查询会弹出一个页面有10秒钟的更新提示图形示意结果24匹配序列描述带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列匹配情况，分值，e值具体匹配情况将四条序列保存在一个txt文档中4.3DNAMAN同源序列比对获取保守区域4.4PrimerPrimier引物设计与筛选4.5Oligo引物的评价分析Ctrl+O打开序列显示引物的位置和长度选择的引物左右拖动到引物的位置点击Change–CurrentOligoLength，更改引物的长度（默认为21）移动这个标尺到引物起始的地方此处会显示你选择的引物的位置，可通过点击下面的标尺进行调整引物的Tm值在72℃左右最佳；合理的Tm值应在60~75℃，退火温度比Tm低5℃；上下游引物的Tm差不应超过5℃。GC%应在40~60%可见此对引物的Tm值不符合要求，可考虑在5’端加几个G或C，再做分析。找到上下游引物的位置后，点击Analyze–PCR使用Oligo7自带的引物设计功能搜索引物点击Search–forPrimers&Probes使用默认参数双击第一条结果这是对此引物的PCR反应的归纳，最具有参考价值。而且没有Comments，说明这个结果可以被接受。Oligo的引物搜索结果先检查各条结果的产物序列是否位于保守区！切换到Sequence窗口，中间一个框显示了选择的正反引物的位置和长度，点击i标志3’ΔG的绝对值不要超过9，否则会在错配点形成双链接下来进行引物具体分析。点击Analyze分析二聚体和发夹结构点击Analyze–DuplexFormation–ForwardPrimer发夹结构要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3上游引物间形成二聚体要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3下游引物的二聚体和发夹结构分析碱基组成和Tm值点击Analyze–Composition&Tm–ForwardPrimer不同算法得到的Tm值要在50~70℃GC%要在40%~60%下游引物的Tm值和GC%，与上游引物不能相差太大。分析错误引发位点点击Analyze–FalsePrimingSites–ForwardPrimer一般，错误引发效率应在100以下。若正确引发效率大于400，该值可适当放宽。这里是可以接受的。正确引发效率为437（超过阈值）下游引物的错误引发效率通过上述分析，引物评价完成。将结果保存。将筛选出来的引物逐个在Oligo7软件中评估。点击Edit–ForwardPrimer，编辑上游引物。可以在5’端前添加G或C以提高Tm值，或加入酶切位点，然后再做Analyze。决定后，将该引物选中，Ctrl+C、Ctrl+V粘贴：GCCAGTTCTGATATTTACACC同理，编辑并保存下游引物下游引物：AATGAAATCCAGTACGCTTC，方向默认是5’→3’4.6引物的二次筛选引物确定后，要在数据库中进行BLAST比对。注意：该病毒基因组中CP基因之外的其它基因是否也能和引物匹配；该病毒寄主（菜豆）基因组是否有和引物匹配的片段（因为有时病毒存在于寄主中，因而扩增的模板就包含两个物种的基因组）。如果是，就要弃掉这样的引物，以防止PCR出现非特异性扩增。1、进入网页：/BLAST/

2、点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项3、进入blastn界面GCCAGTTCTGATATTTACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATGAAATCCAGTACGCTTC（1）输入上下游引物序列，都从5→3，中间用20个以上的N隔开Others（2）在Database选中Others数据库SomewhatsimilarsequencesShowresultsinanewwindow打钩AlgorithmparametersExpectthresholdWordsizeExpect值越高，匹配到的结果序列越多Word-size，字长。BLAST的字长缺省值为11，即BLASTN将扫描数据库，直到发现那些与未知序列的11个连续碱基完全匹配的11个连续碱基长度片段为止。降低字长能增加搜索到的结果。基因找到了目的基因，可见引物的正确性没有问题。五、使用Primer–BLAST工具快速设计引物Primer–BLAST为NCBI开发的一款引物在线设计工具，将引物设计和序列比对一步完成，从而快速筛选获得的引物。上传模板序列如果你已经设计好了引物，可以来验证引物的好坏。这里是引物设计，所以不用填对上传的模板序列返回10对引物设定Tm值选择引物比对的数据库和物种搜索的结果对每对引物进行分析后，根据实验需求选择合适的引物用于合成，然后进行PCR。注意：在选择数据库时，BLAST提供了4种数据库：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。一些Tips

1，在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession号（尽量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填AccessionNumber时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession号（Primer-BLAST有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”）。因为用Gi号或Accession号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。3，尽量使用没有冗除的数据库（如refseq_rna或genomedatabase），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。4，请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。小结一、引物设计流程（1）序列查找和下载GenBank数据库（2）同源性比较获取高度保守的序列，PCR引物应位于其中（3）引物设计与筛选PrimerPremier、Oligo、Primer-BLAST小结一、引物设计流程（4）引物加工与修饰酶切位点、特异性标签（5）引物评价分析Oligo（6）引物二次筛选BLAST（7）进行PCR实验做最终评估小结二、引物设计原则（1）引物长度18~27bp（2）引物特异性引物应位于保守区内（做模板同源性比对）（3）引物碱基分布3’端避免出现GGG、CCC，末端避免出现A小结二、引物设计原则（4）引