实验一凝集试验

实验一

凝集试验

目的要求:

1、掌握玻片凝集试验和试管凝集试验的操作技术。

2、掌握凝集反应中阴阳性结果的判定。

凝集试验：抗原与相应抗体结合，在电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（agglutinationtest，agg）反应中的抗原——凝集原抗体——凝集素

凝集试验的类型：直接凝集试验间接凝集试验协同凝集试验桥梁凝集反应病毒的血凝和血凝抑制试验一、直接凝集试验

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合并出现凝集现象称直接凝集试验(directagglutinationtest)。按操作方法分玻片法和试管法两种。（一）试管凝集试验

实验材料:

1、布氏杆菌试管凝集抗原

由兽医生物药品厂生产供应。该抗原为布氏杆菌死菌混悬液，每1ml约含菌100亿。是将牛型、羊型、猪型三型布氏杆菌的培养物杀死，悬浮于0.5%的石炭酸生理盐水中制成。静置时上层清亮无色或略呈灰白色，瓶底有菌体沉淀。用时需充分摇匀，并用0.5%的石炭酸生理盐水按规定倍数稀释（1：20）。

2、布氏杆菌病待检血清

从被检动物采取。被检血清必须新鲜、无明显蛋白凝块、无溶血现象和腐败气味，采血后不得迟于2～3d检验。否则需加防腐剂或冰冻保存。

3、布氏杆菌阳性血清

由兽医生物药品厂生产供应。通常取自人工免疫的家畜，也可从送检血清中选取。其凝集价不能低于1：800。

4、布氏杆菌阴性血清由兽医生物药品厂生产供应。

5、0.5％石炭酸生理盐水自配

实验方法与步骤:

（一）布氏杆菌试管凝集试验按下表术式加样操作。布氏杆菌试管凝集试验术式表

管号1234567最终血清稀释度1:251:501:1001:200对照

抗原阳性血清阴性血清

1:201:251:250.5%石炭酸生理盐水（ml）被检血清（ml）

2.30.50.5

0.50.20.50.5

0.5

弃1.5弃0.5

0.5－

－

－

0.50.51:20抗原（ml）0.5

0.50.50.50.50.50.5混匀，37C温箱4～l0h，取出后置室温18～24h，观察并记录结果结果﹟+++

++

－

－﹟－

加样：①每份血清用4支试管，另取对照试管3支，置试管架上。②按上表在各管中先加0.5％石炭酸生理盐水。③以1ml吸管吸取待检血清0.2ml，加入第1管中，充分混匀，吸出1.5ml弃之，再吸出0.5ml

加入第2管，混匀后吸出0.5ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后弃去0.5ml。④第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5ml⑤第7管中加1:25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5ml⑥每管各加以0.5％石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌试管凝集抗原0.5ml。

作用：在各试管加完抗原后，将7支试管同时充分混匀，置37℃培养箱中4～l0h，取出后置室温18～24h，然后观察并记录结果。

结果记录：

﹟：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状（即100％的菌体被凝集）

+++

液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上（75％菌体被凝集）。

++

液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀，振荡时有块状或小片絮状物（50％凝集）

+

液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的沉淀或仅有沉淀的痕迹（25％菌体被凝集）

－：液体不透明，管底无凝集，有时管底可见有一部分沉淀，但振荡后立即散开呈均匀混匀

确定被检血清凝集价（滴度）：

以出现“++”以上凝集现象的血清最高稀释度为终点。布病判定标准：

阳性：牛、马和骆驼凝集价1:100以上猪、绵羊、山羊和狗1:50以上可疑：牛、马和骆驼1:50

猪、羊等1:25待检血清稀释度：猪、羊、狗

1:25，1:50，1:100，1:200

牛、马、驼

1:50，1:100，1:200，1:400

大规模检疫可只用两个稀释度。猪、羊、狗1:25和1:50

牛、马、驼1:50和1:100

（二）玻片凝集试验材料：

1、布氏杆菌玻片凝集反应抗原

2、布氏杆菌病待检血清

3、布氏杆菌阳性血清

4、布氏杆菌阴性血清方法与步骤：①取洁净载玻片一块，中间滴1滴布氏杆菌待检血清；另取载玻片一块，左侧滴1滴布氏杆菌阳性血清，右侧滴1滴布氏