疫苗制备工艺

疫苗制备工艺

在发展中国家，死亡总人数的30%～50%死于传染病。

在发达国家，传染病死亡人数仅占死亡总人数的4%～8%，主要得益于疫苗的广泛应用。第一部分

疫苗概述

疫苗与药物的不同点一般药物疫苗对象年龄目的种类结果病人健康人群不同年龄段的患者婴幼儿和儿童治疗疾病/减轻病人的症状通过免疫机制使健康人预防疾病天然药物、化学合成药物、生物药品等生物制品减轻病痛彻底控制消灭某一种疾病（如：天花、脊髓灰质炎）第一节

疫苗概念的产生及其背景一、疫苗的产生及其背景"12世纪，中国开始用人痘接种预防天花"

----《疫苗可预防疾病的流行病学与预防学》

第6版（2000年）

美国疾病控制与预防中心出版天花（Smallpox）临床表现：主要为严重毒血症状（寒战、高热、乏力、头痛、四肢及腰背部酸痛，体温急剧升高时可出现惊厥、昏迷）、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱，最后结痂、脱痂，遗留痘疤。传播途径：飞沫吸入或直接接触；来势凶猛，发展迅速，对未免疫人群感染后15-20天内致死率高达30％。天花（Smallpox）由天花病毒引起的一种烈性传染病，患者在痊愈后脸上会留有麻子，故名“天花”。天花病毒：外观：呈砖形（200纳米×300纳米）抵抗力较强：能对抗干燥和低温，在痂皮、尘土和被服上，可生存数月至一年半之久天花的防治----中国宋真宗时期(998-1023年)

：人痘法--预防天花医者从症状轻微的天花病人身上进行人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡明朝隆庆年间(1567-1572年)：人痘法--趋于完善人痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法等多种接种方法人痘法的缺点：有时也会引起严重的天花天花的防治----欧洲1721年，人症接种法传入英国英国医生E.Jenner(1749-1823)1796年，利用牛痘防治天花1798年，医学界正式承认"疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法"。1980年，世界卫生组织(WHO)宣布:全球消灭了天花疫苗之父---法国免疫学家LouisPasteur细菌的分离培养技术减毒菌株的获得连续传代培养法（1870年）鸡霍乱弧菌减毒株（第一个细菌减毒活疫苗）高温培养法（1881年）炭疸菌苗异体传代法：将狂犬病毒在兔体内经连续传代，获得了减毒株

巴氏减毒菌苗的发明：为实验免疫学建立了基础疫苗的定义一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品，统称为疫苗包括:蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等二、疫苗的种类1.按所用材料分类：细菌性疫苗（旧称：菌苗）病毒性疫苗（旧称：疫苗）类毒素2

.按疫苗研制技术分类：传统疫苗灭活疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗：用天然微生物的某些成分制成新型疫苗项目减毒活疫苗灭活疫苗亚单位疫苗抗原用减毒或无毒的全病原体作为抗原用化学或物理方法将病原体杀死以化学方法获得病原体的某些具免疫原性的成分免疫机理接种后病原体在体内有一定生长繁殖能力，类似隐性感染，产生细胞、体液和局部免疫病原体失去毒力但保持免疫原性，接种后产生特异抗体或致敏淋巴细胞接种后能刺激机体产生特异性免疫效果优缺点接种次数少，反应小，免疫效果持久。稳定性较差，并应考虑减毒株毒力返祖问题一般要接种2-3次，反应较大，维持时间较短。稳定性好，较安全制品纯度较高，副反应小，需多次接种常用疫苗卡介苗、麻疹、鼠疫、脊髓灰质炎减毒活疫苗伤寒、霍乱、百日咳、乙脑、脊髓灰质炎灭活疫苗白喉、破伤风类毒素，A群脑膜炎球菌多糖疫苗新型疫苗基因工程亚单位疫苗基因工程载体疫苗核酸疫苗基因缺失活疫苗重组疫苗合成肽疫苗抗独特型抗体疫苗新型疫苗基因工程亚单位疫苗----灭活疫苗基因工程载体疫苗--------活疫苗核酸疫苗-------------------------------特殊的疫苗基因缺失活疫苗----------灭活疫苗重组疫苗--------------------灭活疫苗合成肽疫苗-----------------灭活疫苗抗独特型抗体疫苗--------灭活疫苗疫苗的发展经典的病毒疫苗和细菌疫苗

寄生虫疫苗、肿瘤疫苗、避孕疫苗等;预防性疫苗

治疗性疫苗。三、疫苗的基本成分、性质和特征1.疫苗的基本成分抗原佐剂防腐剂稳定剂灭活剂缓冲液、盐类等非活性成分（1）抗原:疫苗最主要的有效活性成分基本条件异物性一定的理化特性特异性灭活病毒或细菌活病毒或细菌/减毒株病毒或菌体提纯物有效蛋白成分类毒素细菌多糖合成多肽DNA。（2）佐

剂理想的佐剂：增强抗原免疫应答无毒、安全在非冷藏条件下保持稳定作用机制改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的提呈能力；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力。常规免疫佐剂：常规免疫佐剂：铝盐类佐剂、蜂胶佐剂、油水乳剂。新型免疫佐剂：新型免疫佐剂：细胞因子、CpGDNA、基因工程减毒素、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体。按物理性质生物学性质佐剂在体内的存留时间颗粒性佐剂非颗粒性佐剂微生物及其组分非微生物物质贮存型佐剂非贮存型佐剂其他分类：铝盐类佐剂蜂胶佐剂油水乳剂（一）常规免疫佐剂常规佐剂1：铝盐类佐剂1）氢氧化铝胶：铝胶。

2）明矾：硫酸铝钾制成10%溶液，高压灭菌；调菌液pH至8±0.1，加入明矾液1~2%，充分混匀。

3）磷酸三钙：在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀。常规佐剂2：蜂胶(propolis)

蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉、其它一些有机和无机物的一种天然物质。是一种天然的免疫增强剂。常规佐剂3：油水乳剂佐剂

由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，是制备兽用灭活疫苗时广泛运用的另一种佐剂。免疫刺激复合物细胞因子类CpGDNA（二）新型免疫佐剂（3）防腐剂目的：防止外来微生物的污染大多数的灭活疫苗都使用防腐剂硫柳汞硫柳汞副作用：接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性（4）稳定剂保证作为抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性；冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等。

灭活（inactivation）：破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但不损害其免疫原性，用以制备灭活疫苗。灭活方法：物理方法：加热、紫外线和射线照射化学方法：化学试剂，如甲醛，β-丙内酯等。甲醛是最常用的灭活剂。

灭活剂（inactivator）：用于灭活微生物的化学试剂如甲醛溶液、烷化剂、苯酚、结晶紫、β-丙酰内脂等。（5）灭活剂(一)甲醛溶液(Formaldehydesolution)

甲醛为无色气体，有强烈的刺激性，对眼、鼻黏膜和上呼吸道有刺激性。易溶于水合乙醇。其水溶液（36%～40%）称为福尔马林(Formalin)。甲醛最古典的灭活剂，但也是目前最主要的灭活剂。

灭活机理：甲醛的醛基与蛋白质的氨基、羧基、羟基和巯基反应，分别形成羟甲基胺、亚甲基二醇单酯、羟甲基酚和硫代亚甲基二醇等，使病毒、细菌等微生物的蛋白质构象发生改变，从而使其失活。但对其免疫原性无明显影响。另外，甲醛还可以与核酸中的碱基（A、G和C）上的氨基反应，与核糖体蛋白的氨基反应，从而影响核酸和核糖体的功能。无囊膜的二十面体对称病毒有囊膜的二十面体对称病毒有囊膜的螺旋对称病毒甲醛与蛋白的氨基结合形成羟甲基或二羟甲基衍生物，后者与酰胺或胍基团反应导致蛋白变性。甲醛与核酸中含氨基的A、G、C反应使核酸变性。灭活用甲醛浓度：

基本原则：浓度随不同微生物而异。

1）需氧菌：0.1%～0.2%。

2）厌氧菌：0.4%～

0.5%。

3）病毒：0.05%～0.4%

。其他灭活条件：37℃，24～48hrs。有时灭活时间会更长，如破伤风类毒素用0.4%的甲醛，37℃需灭活21～

23天。（二）烷化剂(alkylatingagent)AEI：N-乙酰基乙烯亚胺BEI：二乙烯亚胺GDA：缩水甘油醛烷化剂的灭活机制：1）烷化DNA分子中的G或A，引起单链断裂或双链交联，改变DNA的结构而破坏其功能。

2）可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。这类灭活剂能破坏病毒的核心，使病毒完全丧失感染力，一般不损害其衣壳蛋白，故能维持其免疫原性。灭活机制：使微生物的蛋白质变性，或抑制微生物的特异酶系统，使其失去活性。制备疫苗时的用量：0.3%～0.5%。（三）苯酚(phenol)（四）结晶紫(crystalviolet)

一种碱性染料。

灭活机制：其阳离子与微生物蛋白质带负电的羟基形成弱电性化合物，妨碍微生物的正常代谢。（五）β-丙内酯(propiolactone,β-PL)

一种良好的病毒灭活剂，但具有致癌性

作用机理：可能是作用于病原体的DNA和RNA，而不直接作用于蛋白，有利于维持病毒的免疫原性。

1984年被选为狂犬病灭活苗的制备。筛选灭活剂的基本原则：

选择合适的灭活剂，或研发更为优良的灭活剂是生物制品行业的一项重要工作。目前，甲醛最常用，N-乙酰基乙烯亚胺(AEI)和二乙烯亚胺(BEI)也被使用。筛选原则：

1）病原体完全灭活：安全性好

2）最大限度的保持病原体的抗原性：在消除病原体感染性的同时，维持其蛋白质天然的三维结构和抗原表位等。

3）灭活步骤更为简单有效。（6）缓冲液、盐类

缓冲液的种类、盐类的含量都可影响疫苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格的质量标准第二部分疫苗制备工艺

菌种的选择菌液培养灭活

配苗浓缩

菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，但制造的基本程序差别不大。一、细菌性疫苗制备工艺○细菌性灭活疫苗制造（一）菌种与种子

1.菌种

制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。2.种子培养将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（二）菌液培养

大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。

菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（三）灭活

灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表所示。表几种灭活菌苗的灭活方法

菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗（四）浓缩

为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法

以上方法可使菌液浓缩一倍以上。

菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗

（五）配苗与分装

由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。

氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。菌种的选择菌液培养灭活浓缩配苗弱毒菌种多系冻干品，由中国药品生物制品检定所或中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经检查合格者即可作为种子液。种子液通常在0～4C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。

细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子○细菌性活疫苗制造菌种的选择菌液培养浓缩配苗按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液菌液于0～4C暗处保存，待抽样经活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养菌种的选择菌液培养浓缩配苗

经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。（四）配苗与冻干

为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作活菌数等检查。（三）浓缩菌种的选择菌液培养浓缩配苗流程图1——细菌疫苗制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒检验配制灭菌检验配制灭菌原料佐剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培养菌苗原液配苗活疫苗保护剂菌液分装、冻干分装灭活原料活化种子举例白喉疫苗外毒素对神经系统损害细菌产生的外毒素对心肌损害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉流行三个特点传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌没有中间宿主，病人及带菌者是一的传染原。传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。二、病原学白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不行成芽孢。白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感；对消毒剂抵抗力弱，1％石碳酸1min或3％苯酚10min可将该菌杀死。不耐热，58℃10min或100℃1min即可被杀死。白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的三、白喉毒素白喉毒素对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。通过物理和化学方法将其纯化。四、白喉类毒素细菌毒素甲醛类毒素类毒素：用0.3%～0.4%甲醛溶液对外毒素进行脱毒处理后获得的失去毒性但仍保留其免疫原性（抗原性）的生物制品。白喉和破伤风疫苗是两种常用的基于类毒素的疫苗制剂。在白喉毒素生产的最初阶段需要培养白喉棒状杆菌，然后处理产生的毒素来制备类毒素。破伤风的生产工艺类似。影响脱毒因素甲醛浓度温度PH脱毒温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～38℃。在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，可导致脱毒过甚；在碱性时脱毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。

五、白喉疫苗工艺流程示意图

菌种（PW8株）

传代扩增3～4代

发酵罐培养34～35℃培养40～48h对数生长末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体收集清液超滤浓缩3万分子量超滤浓缩

硫酸铵盐析两段盐析除盐除菌氨离子及无菌检查脱毒0.5％甲醛液37℃40～50天脱毒试验（家兔）原液检定（浓度、纯度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品检定（安全、效价等）二、病毒疫苗制造

病毒性禽胚培养疫苗制造

病毒性细胞培养疫苗制造

病毒性动物组织疫苗制造病毒性禽胚培养疫苗制造

痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获配苗（一）鸡胚选择

受精卵应来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养。（二）种毒与毒种继代

目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作为生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。种毒与毒种继代鸡胚选择接毒与收获配苗（三）接毒与收获

鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。接种途径：绒毛尿囊膜接种11~12日龄胚尿囊腔接种9~11日龄胚羊膜腔接种10~12日龄胚卵黄囊接种5~8日龄胚如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10-3稀释毒种0.1ml，后者接种10-4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.接毒接毒与收获鸡胚选择种毒与毒种继代配苗

鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度60%~70%条件培养增殖，收集接毒后24~48h内死亡胚，置0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48~120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。2.培养收获

按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。

1.湿苗通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放置0~10C冷暗处处理后分装。

2.冻干苗经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素500~1000U，混合后分装冻干。

3.灭活苗

收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。（四）配苗配苗鸡胚选择种毒与毒种继代接毒与收获流程图2——病毒性禽胚疫苗制造工艺流程受精卵禽胚毒株种毒灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原料佐剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液配苗活疫苗保护剂分装、冻干分装灭活原料种子扩增收获配制纯化病毒悬液接种病毒性细胞培养疫苗制造

细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备（一）种毒与毒种继代

用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。

制造疫苗用的细胞大体为原代细胞和传代细胞两类，根据病毒种类、疫苗性质与工艺流程选择不同的细胞。

选择的依据包括：病毒的适应性高、毒价高、细胞来源方便、制备简单、生命力强。如猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞疫苗采用犊牛睾丸原代细胞；脊髓灰质炎活疫苗选择vero细胞；狂犬病弱毒细胞适应疫苗采取BHK21细胞增殖病毒等。（三）细胞制备

接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备

培养细胞和增殖病毒用的营养液又称培养液，通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的之处通常只是生长液内含有5%-10%的血清；维持液血清浓度为2%-5%。不同细胞所需的营养成分和生长条件不尽相同。目前常用的细胞培养方法为静止培养和转瓶培养，至于微载体培养和悬浮培养在我国尚处于试验之中。（四）接毒与收获

病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备（五）配苗1．灭活疫苗不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2．冻干苗细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。

接毒与收获种毒与毒种继代配苗细胞制备流程图3——病毒性细胞疫苗制造工艺流程动物或胚胎组织毒株种毒灭活病毒消化鉴定培育培养检验检验配制原料佐剂传代细胞配苗（混匀、乳化）灭活疫苗细胞悬液生长细胞配苗活疫苗保护剂原苗分装、冻干分装灭活原料原料细胞培养液配制剪碎种子鉴定扩增收获配制灭菌病毒性动物组织疫苗制造

病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissuevaccine)。动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。观察与收获动物选择配苗种毒与接种（一）动物选择动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准：

(1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物；

(2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。

种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合