实时荧光定量RTPCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3mRNA的表达

实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核

细胞中F0XP3mRNA的表达蒋卫平，丁茂文，朱亚非，李冰，朱晚林，李欣华，林菲菲【摘要】目的：成立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反映(real-timefluorescencequantitativeRT-PCR)检测人外周血单个核细胞中FOXP3mRNA的方式，并研究其与CD4+CD25+Treg细胞活性相关性。方式：提取人外周血单个核细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA,以B-actin为内参照，实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3mRNA的相对表达量，采纳融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性；同时采纳流式细胞技术检测CD4+CD25+Treg细胞含量，分析二者相关性。结果：哮喘患儿组CD4+CD25+Treg细胞百分率明显低于同龄对照组，PV；FOXP3mRNA的表达也显著降低，PV；FOXP3和B-actin的融解曲线分析说明均仅有单一峰,Tm值别离为°C和C；琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3mRNA表达水平简便易行、结果稳固靠得住。初步结果证明，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3mRNA表达有相同的趋势，存在必然的相关性。【关键词】实时荧光定量RT-PCR；哮喘；FOXP3；CD4+CD25+调剂性T细胞Abstract:Objective:Toestablishareal-timefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）todetectFOXP3mRNAexpressioninhumanperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）andtoinvestigatethecorrelationsbetweenactivityofCD4+CD25+regulatoryTcellsandexpressionofFOXP3mRNA.Methods:TotalRNAwasextractedwithTrizolfromhumanPBMCsandmRNAwastranscribedreverselyintocDNA.Real-timefluorescentquantitativeRT-PCRwithB-actinastheinternalcontrolgenewasusedtodetecttheexpressionlevelsofFOXP3mRNAin29pediatricpatientswithasthmaand24age-matchedhealthychildren.ThespecificityofPCRproductionswasidentifiedwiththedissociationcurvesandagarosegelelectrophoresis.FlowcytometryanalysiswasusedtoassessthepercentageofCD4+CD25+regulatoryTcells.Thecorrelationbetweentheexpressionandactivitywasanalyzed.Results:ThepercentagesofCD4+CD25+regulatoryTcellsingroupofasthmaweresignificantlylowerthanthoseingroupofcontrol（P<，sodidtheexpressionsofFOXP3mRNA（P<.TheanalysisofdissociationcurvesonFOXP3andB-actinshowedthatbothofthemhadonlyonesimplespikeandtheTmvalueswere°Cand°C,respectively.TheagarosegelelectrophoresisofthemshowedonlysinglePCRproducteach.Conclusion:ItisaneasyandreliabletesttodetecttheexpressionlevelofFOXP3mRNAbySYBRGreenIreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRandthepreliminaryexperimentalresultshowsthatthepercentagesofCD4+CD25+regulatoryTcellsandtheexpressionsofFOXP3mRNAhavethesametrendandconfirmsthecorrelationbetweenthem.Keywords:real-timefluorescencequantitativeRT-PCR；asthma；forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor；CD4+CD25+regulatoryTcellsCD4+CD25+调剂性T细胞（Treg）是具有免疫抑制功能的一群T细胞，在维持机体免疫自稳、免疫耐受和避免自身免疫性疾病的发生方面具有十分重要的作用，叉状头/翅膀状螺旋转录因子（forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F0XP3）特异地高表达于CD4+CD25+Treg，介导CD4+CD25+Treg在胸腺的发育、外周的表达及功能的维持，可反映CD4+CD25+Treg活性水平［1-3］。支气管哮喘（以下简称哮喘）是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）和肥大细胞等多种炎性细胞、炎症介质和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，其发病进程与效应性CD4+T细胞尤其是II型辅助性T细胞（Th2）活化并分泌多种细胞因子紧密相关；CD4+CD25+Treg可能通过其免疫抑制功能抑制Th2细胞的活化而阻止哮喘的发生和进展［4］。本实验成立了SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中F0XP3mRNA的表达，并验证了其与流式细胞术检测CD4+CD25+Treg表达的相关性，现报导如下。1材料和方式材料标本来源：2020年2月至5月在我院小儿科就医的29例哮喘患儿（病程2〜8年）及24例正常对照共计53例，年龄3〜14岁，平均（6±2）岁，其中男32例，女21例，患儿诊断均符合中华医学会儿科学会呼吸组制定的哮喘诊断标准［5］，正常同龄对照组均为无过敏性疾病史的健康儿童；别离采取两管EDTA抗凝的静脉血2mL，及时送检。要紧仪器：BDFACSCalibur流式细胞仪，罗氏LightCycler荧光PCR仪，电泳分析系统及凝胶成像系统。试剂：多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP）标记的CD45单克隆抗体（McAb）、人异硫氰酸荧光（FITC）标记的CD4McAb、藻红蛋白（PE）标记的CD25McAb均购自美国BDPharMingen公司；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技；总RNA提取试剂盒Trizol、第一链cDNA合成试剂盒、热启动荧光定量PCR核心试剂盒（SYBRGreenI染料法）均购自上海闪晶分子生物科技；引物序列由上海闪晶分子生物科技合成纯化。方式流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例：别离加入6uLPerCP标记的CD45McAb、10卩LFITC标记的CD4McAb和PE标记的CD25McAb于50uL的EDTA抗凝血中，避光孵育15min，加入溶血素，避光溶血10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，1200r/min离心5min，弃上清，再用500uLPBS重悬细胞，上流式细胞仪（BD公司）检测，结果用CellQuest软件处置。引物设计：依照GeneBank提供的FOXP3mRNA序列（GeneBank号：AF277993）和B-actin序列（GeneBank号：AY399813）设计引物。目的基因FOXP3引物：上游（5'to3'）F：CTGACCAAGGCTTCATCTGTG，下游（5'to3'）R：ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC，扩增片段长度为176bp，内参基因B-actin引物：上游（5'to3'）F：TGACGTGGACATCCGCAAAG，下游（5'to3'）R：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG，扩增片段长度为205bp。淋巴细胞分离：取2mL的EDTA抗凝血加2mL淋巴细胞分离液，倒置混匀，然后在2000r/min离心20min。总RNA提取：①警惕吸取上述分离的中间层白细胞（单个核细胞）放入mL离心管（RNase-Free）中，然后加入ImLTrizol,倒置混匀后，室温放置5min,使其充割裂解，最后放入-80°C冰箱保留备用。②将所有冰箱里的标本掏出室温解冻后，12000r/min离心5min,弃沉淀。③加入200卩L氯仿（4C预冷），倒置混匀后室温放置15min,4C12000r/min离心15min。④吸取上层水相至另一离心管（RNase-Free）中，加入mL异丙醇（-20C预冷）倒置混匀数次，室温放置5~10min，4C12000r/min离心10min，弃上清,RNA沉于管底。⑤加入75%乙醇（-20C预冷），温和振荡离心管,悬浮沉淀，4C8000r/min离心5min,尽可能弃上清。⑥室温晾干或真空干燥5〜10min,最后加入50uLDEPC处置的H2O,适当混匀，稍事离心备用。逆转录：①取上述RNA提取物8uL加入1uL0ligo（dT）18primer,警惕混匀，65C保温5min,室温放置10min,室温高速离心5s,将所有溶液搜集到管底。②顺顺序别离加入以下试剂：2XFirst-StrandBuffer10uL,RT-mix1uL,整体积为20uL。警惕混匀稍事离心，42C50min,然后90C处置5min,冰上冷却，室温咼速离心5s,将所有溶液搜集到管底，-20°C保留备用。荧光定量PCR反映体系：①HotstartFluo-PCRmix：10uL,②上游引物(50pmol/uL)：uL,③下游引物(50pmol/uL)：uL,④无菌去离子水：uL,⑤上述逆转录后的cDNA：2uL；一个反映体系的整体积为20uL。扩增条件设置①93C预变性2min；②93C变性15s,60C退火20s,72C延伸30s,40个循环，每一个循环延伸后搜集一次荧光，分析模式设定为定量分析；③93C变性15sec,72C延伸1min，最后设定温度93C,温度转变速度为C/sec，持续监测荧光，进行熔解曲线分析。仪器检测通道选择F1通道。扩增产物电泳分析:①将扩增后的毛细反映管警惕开盖倒扣在mL的离心管中，4000r/min离心20s,将产物全数搜集到离心管中。②配1%琼脂糖凝胶，制成电泳胶板(分子克隆实验指南)，取5uL扩增产物加luLloadingbuffer混匀后上样，在100V的电压下电泳20min,最后在凝胶成像系统中拍照成像。结果计算：用相对定量的研究方式分析实验结果。FOXP3/&-actin比值采纳2—△Ct方式计算，二Ctl—Ct2。统计学处置方式：经方差齐性查验后，采纳t查验比较两组间不同，用简单直线相关分析探讨两因素之间相关性。2结果荧光定量方式学评判①特异性F0XP3和B-actin扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见约176bp和205bp特异性条带显现，与理论上的目的片段长度完全一致，同时进行熔解曲线分析，判定F0XP3和B-actin均只有一尖峰，解链温度（Tm值）别离为°C和°C,说明别离仅有一扩增产物（见图1〜3）。②线性范围与最低检测限定量浓度用Ct值的负对数表示，将逆转录产物cDNA进行10倍倍比稀释，最低检测限为反映，线性范围为〜反映，相当于Ct值从18到37的跨度，相关系数为。③周密度：取2份浓度高低不同（Ct值为21和35）的标本重复测定4次,测定结果经对数处置后其批内CV值为〜％,批间CV值为〜％。哮喘患儿CD4+CD25+Treg明显下降29例哮喘患儿与24例正常儿童CD4+CD25+Treg检测结果别离为（土）％和（土）％，不同有显著性（PV）。哮喘患儿FOXP3mRNA改变29例哮喘患儿与24例正常儿童F0XP3/B-actin的2-△Ct值别离为土和土，二者不同也有显著性（PV）。FOXP3mRNA与CD4+CD25+Treg二者相关性分析FOXP3mRNA在外周血单个核细胞中的表达与CD4+CD25+Treg在淋巴细胞中的比例呈必然的正相关（r=,PV,见图4）。3讨论随着免疫学及分子生物学研究的深切，愈来愈多的证听说明免疫功能紊乱在儿童支气管哮喘发病机制中起着重要作用，尤其是淋巴细胞亚群的比例和功能紊乱更是当前关注的热点。众所周知，免疫耐受的破坏和Thl/Th2功能失调是哮喘发病的重要环节。目前以为CD4+CD25+Treg是机体免疫系统维持外周耐受的重要调控者，维持其正常的水平和功能将有助于免疫系统对自身抗原的刺激成立良好的耐受状态，从而可抑制哮喘的发生［6］。FOXP3作为一特殊的转录因子特异地高表达于CD4+CD25+Treg上，与其发育和功能成熟紧密相关［7-8］。咱们通过流式细胞仪和实时荧光定量RT-PCR检测发觉，哮喘患儿外周血CD4+CD25+Treg的比例及F0XP3mRNA的表达低于同年龄的正常对照组，说明哮喘患儿由于CD4+CD25+Treg数量不足，免疫抑制功能下降，致使效应性CD4+T细胞尤其是Th2细胞大量活化，产生大量致炎因子致使哮喘发作或持续；能够假想，这种患者通过医治或自然减缓后，CD4+CD25+Treg数量和F0XP3mRNA的表达升高，接近于正常水平，发挥其免疫抑制功能，抑制Th2细胞活化，纠正Thl/Th2失衡，增进哮喘减缓，提示CD4+CD25+Treg参与了哮喘的发生和进展。SYBRGreenI实时定量PCR与一般PCR相较，具有灵敏、快速、特异的特点。因无需合成特异探针，利用方便；但同时非特异产物可干扰靶基因的产物定量。SYBRGreenI是一种荧光染料，能非特异性地结合到双链DNA中去，一旦结合到双链DNA中后即能够发出荧光，结合状态的荧光强度较游离状态强百余倍，因此能够依照荧光信号强度定量检测双链DNA数量。可是SYBRGreenI与双链DNA结合缺乏特异性，在PCR反映中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，可能会发生假阳性。为了幸免这种不利因素，本研究在定量反映终止后进行融解曲线分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号。分析PCR产物的融解曲线能够证明扩增产物的特异性，特异PCR产物在融解曲线上是单一峰，其Tm值较非目的产物高［9］。咱们发觉，FOXP3和B-actin的融解曲线均仅有单一峰，Tm值别离为°C和°C；琼脂糖电泳进一步证明了其扩增特异性。本文初步结果证明，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和F0XP3mRNA表达有相同的趋势，存在必然的相关性。咱们成立了一种从外周血单个核细胞中检测FOXP3mRNA的方式，其方式简单，重复性好，并有很高的灵敏性和特异性。【参考文献】FontenotJD,GavinMA,RudenskyprogramsthedevelopmentandfunctionofCD4+CD25+regulatoryTcells[J].NatImmunol,2003,4(4):330-336.KhattriR,CoxT,YasaykoSA,etalAnessentialroleforscurfininCD4+CD25+Tregulatorycells[J].NatImmunol,2003,4(4):337-342.HoriS,Nomura