第2章 色谱基本理论

概述色谱流出曲线基本原理两个理论定性与定量第二章色谱基本理论概述色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。碳酸钙色素石油醚色谱的两个相固定相不动的一相流动相携带样品流动的流体当流动相中样品混合物经过固定相时，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱的分类色谱流出曲线及有关术语流出曲线和色谱峰基线柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值。理想的基线应该是一条水平直线。色谱峰检测器对流动相中被分离组分的响应讯号的记录值保留值死时间不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。保留时间

试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间。调整保留时间由于组份的tR包含了组份通过柱子的时间和在固定相中滞留的时间，所以t'R实际上是组份在固定相中停留的总时间。t'R=tR-tM因物质不被固定相吸附或溶解，其流动速度与流动相的流动速度相近。在测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算。tMtR和t'R保留时间和调整保留时间是色谱法定性的基本依据死体积VM指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（L/min）计算：VM=tM·F0

保留体积VR调整保留体积V'R相对保留值r2.1某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值。

相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。选择因子α在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号α表示：式中t'R2为后出峰的调整保留时间，所以α总是大于1的。区域宽度标准偏差σ

是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。0.607倍峰高处色谱峰宽的一半半峰宽W1/2峰高一半处对应的峰宽峰宽W

（基线宽度）色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距峰面积峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。从流出曲线上，可得到许多重要信息：

1.根据峰的个数，判断样品中所含组份的最少个数2.根据峰的保留值，进行定性分析3.根据峰面积或峰高，进行定量分析4.保留值与区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据5.两峰间的距离，是评价色谱条件是否合适的依据6.判断仪器是否正常色谱法分析的基本原理色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离

组分要完全分离，各峰间的距离必须足够远；两峰间距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。

两峰间虽有一定距离，而每个峰都很宽，以致彼此重叠，则也不能分离。峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。分配系数K和分配比k1.分配系数K

色谱分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配、吸附--脱附、离子交换等过程。分配系数是描述分离过程中样品分子在两相间分配的参数，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时的浓度之比。

2.分配比k（k′）

在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比

k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数；也决定于组分和两相的热力学性质，不仅随柱温、柱压变化而变化，还与两相的体积有关。

式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于柱死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。

分配比k可直接从色谱图测得设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以us＜u。此两速度之比称为滞留因子Rs。

3.分配系数K与分配比k的关系

其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱特点的又一个参数。如，对填充柱的β值一般为6～35；对毛细管柱的β值为60～600。

4.分配系数K及分配比k与选择因子α的关系

对A、B两组分的选择因子，用下式表示

上述公式表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对两相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合。两组分的K或k值相差越大，则分离越好两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件两个理论和分离度塔板理论

最早由Martin等人提出。把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数（n）作为衡量柱效率的指标。

iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，且试样组分沿轴（纵）向扩散可忽略

iv）组分的分配系数在所有塔板上是常数，与其在某一塔板上的量无关

i）在柱内一小段长度内，组分在两相间可迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度（H）

ii）以气相色谱为例，载气是脉动而不是连续进入色谱柱的，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）为简单起见，设色谱柱由5块塔板组成；某组分的分配比k=2；组分的量为81。0#1#2#3#4#5427815436182718918/1836241224129631682412211260.670.335.332.6716821.3310.6710.675.33ΔV0ΔV1ΔV2ΔV3ΔV40#81=54+2754=36+1836=24+1224=16+8161#27=18+918+18=24+1224+12=24+1224+82#9=6+36+12=12+612+123#3=2+12+64#1由塔板理论可建流出曲线方程：W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。故n和H是描述柱效能的指标。通常气相填充色谱柱的n＞103，H＜1mm；毛细管柱n=105~106，H＜0.5mm。由于tm包括在tR中，而tm不参与柱内分配，因此n值尽管较大，而H却很小，与实际柱效能相差甚远。所以把tm扣除，用有效塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。

塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程。如，未考虑纵向扩散造成谱带扩张和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数。

1956年VanDeemter等提出的色谱过程动力学理论。它吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气、液相色谱都适用。范氏方程的数学简化式为：式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。速率理论1.涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒阻碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。A＝2λdpA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A＝0。

2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。

B＝2γDgγ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）。3.传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即C＝Cg＋Cl

。传质固定液载体对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为：由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度直径的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。

液相传质阻力系数C1为：上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小。减少固定液的量，可降低df

，但k随之变小，又会使Cl增大。固定液量一定，df随载体的比表面积增加而降低。因此，一般采用比表面积较大的载体来降低df，但比表面太大，由于吸附造成峰拖尾，对分离也不利。提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为有适当的Cl值，应控制适宜的柱温。将上面各式总结，即可得气液色谱速率板高方程：液液色谱速率板高方程为：该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。

4.流动相线速度以及分子扩散项和传质阻力项对板高的影响

5.固定相粒度大小对板高的影响

当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。分离度两峰距离近并且峰形宽；两峰严重相叠，选择性和柱效都很差两峰距离虽远，峰形仍很宽；说明选择性好，但柱效低分离理想；说明选择性和柱效均好单独用柱效或选择性都不能真实反映组分在色谱柱中的分离情况。既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。它又叫分辨率，其定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即分离度RR值越大，表明相邻两组分分离越好当R＜1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。

分离度受柱效（n）、选择因子(α)和容量因子（k）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设k1≈k2=k，W1≈W2＝W。基本色谱分离方程式1.分离度与柱效的关系由分离方程式看出，具有一定α的物质对，R直接和neff有关，说明neff能正确地代表柱效能。分离方程式还表明，R与n的关系还受热力学性质的影响。当两相和被分离物质对的α确定后，R将取决于n。对于一定理论板高的柱子，R的平方与L成正比。用较长的柱子可以增加R，但延长了分析时间。

提高R的好方法是：制备性能优良的柱子，通过降低H，以提高R。

由基本色谱方程式判断，当α=1时，R=0。显然，α越大，选择性越好。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大α值。

2.分离度与选择因子的关系3.分离度与容量因子的关系如果设：则分离方程式写成由图可看出：当k＞1O时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取k为2～10最宜。对于GC，通过提高柱温，可选择合适的k值，以改进分离度。对于LC，只要改变流动相组成，就能有效地控制k值，对分离能起到立竿见影的效果（见下图）。4.分离度与分析时间的关系分析时间与分离度呈指数型正相关关系；分离度越大，所需分析时间越长。5.基本色谱分离方程式的应用例1

有一根lm长的柱子，分离组分1和2得到的色谱图如图所示。图中横坐标为记录笔走纸距离。若欲得到R=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？解：先求组分2对组分1的相对保留值r2,1（即α值）求有效塔板数：neff＝16×0.82×[1.1/(1.1-1)]2＝1239若使R=1.2，所需塔板数可计算，即因此，欲使分离度达到1.2，需有效塔板数为2788块，则所需柱长为：

L=2788/1329×1m=2.25m例2

已知某色谱柱的理论塔板数为3600，组分A和B在该柱上的保留时间为27mm和30mm，求两峰的峰半宽和分离度。解:∵w1/2=w/1.7WA=27/(3600/16)1/2=1.8mm(WA)1/2＝1.8/1.7＝1.06mmWB=30/(3600/16)1/2=2.0mm(WB)1/2＝2.0/1.7＝1.18mmR＝2(30-27)/(1.8+2)＝6/3.8＝1.6例3

已知物质A和B在一个30.00cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.40和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰宽为1.11和1.21min，计算：

(1)

柱分辨本领；

(2)

柱的平均塔板数目；

(3)

塔板高度；

(4)

达到1.5分离度所需的柱长度；

(5)在较长柱上把物质B洗脱所需要的时间。

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16(16.40/1.11)2=3493

nB=16(17.63/1.21)2=3397

nav=(3493+3397)/2=3445=3.44×103(3)H=L/n=30/3445=8.71×10-3cm(4)n2=3445×2.25/1.12=6.92×103

源于n1/n2=(R1/R2)2L=nH=6.92×103×8.71×10-3=60.27cm(5)tR2=tR1(R2/R1)2=17.63×1.52/1.062

=35.44min定性与定量定性分析色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。目前各种色谱定性方法均基于保留值在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法进行定性。1.已知纯物质对照色谱条件不变，则组分的保留时间是一定值。这是色谱定性分析中最方便，最可靠的方法。如果未知样品较复杂，可采用在未知样品中加入已知对照，通过未知样品中哪个峰增大，来确定未知样品中的某成分----加标定性法。只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且被定性成分有标准品（对照品）。2.经验规律当没有待测组分的纯标准样时，用气相色谱中的经验规律定性。（l）碳数规律一定温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中碳原子数成线性关系式中A1和C1是常数，n为分子中的碳原子数（n≥3）。如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其它组分的调整保留值。（2）沸点规律

同族具有相同碳数碳链的异构体化合物，其调整保留时间的对数和它们的沸点呈线性关系式中A2和C2均为常数，Tb为组分的沸点（K）。根据同族同碳数碳链异构体中几个已知组分的调整保留时间的对数值，可求得同族中具有相同碳数的其他异构体的调整保留时间。有时利用相对保留值定性比用保留值定性更为方便、可靠。用保留值定性时，必须使两次分析条件完全一致，有时不易做到。而用相对保留值定性时，只要保持柱温不变即可。方法要求找一基准物质，常选易得纯品的，且与被分析组分相近的物质作基准物质，如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。3.相对保留值又称Kováts指数，重视性较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。也是一种相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度，并假定正构烷烃的保留指数为n100。被测物的保留指数值可用内插法计算。

4.保留指数内插法求IX示意图信号

tR(Z)

tR(i)tR(Z+1)

t进样例下图为乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲线（柱温100℃）。由图中测得调整保留距离为：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正下酯的保留指数。乙酸正丁酯的保留指数为775.6。在与文献值对照时，一定要重视文献值的实验条件，如固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。解：已知n=7色谱与质谱、Fourier红外光谱、发射光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一。5.双柱、多柱6.与其他方法结合对于复杂样品的分析，利用双柱或多柱法更有效、可靠，使原来一根柱子上可能出现相同保留值的两种组分，在另一柱上就有可能出现不同的保留值。当色谱峰峰型好的时候，有时也采用峰高来进行定量计算。定量分析

定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。

峰面积是色谱图提供的基本定量数据，现在几乎都是积分法获得峰面积。注意积分参数的设定需将面积乘上一个换算系数，使组分的面积转换成相应物质的量，即Wi=fi′Ai。式中Wi为组分i的量，Ai为峰面积，fi′为定量校正因子。1.定量校正因子fi′定义为：单位峰面积的组分的量。与检测器灵敏度Si的关系为：fi′=1/Si

定量校正因子同一检测器对不同物质具有不同的响应值，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积；或者说，相同峰面积并不意味着相等的量。相对定量校正因子由于物质量Wi不易准确测量。实际工作中，以相对定量校正因子fi代替定量校正因子fi′fi定义为：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。式中m和A分别代表质量和面积，下标i和s分别代表待测组分和标准物。fi(m)表示相对质量校正因子，由于进入检测器的物质量也可以用摩尔或体积表示，因此也可用相对摩尔校正因子fi(M)和相对体积校正因子fi(V)表示。

凡文献查得的校正因子都是指相对校正因子，可用fM，fm分别表示摩尔校正因子和质量校正因子（通常把相对二字略去）。相对校正因子只与试样、标准物质和检测器类型有关，与操作条件、柱温、载气流速、固定液性质无关。校正因子测定方法：分别准确