高效制备色谱

11.9高效制备色谱

（HighPerformancePreparativeChromatography）

任何一种分离方式均可用于制备目的，色谱和电泳也不例外（注意实际效果！）。本章仅介绍常用的液相色谱方法。

制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。而利用高效液相色谱分离足够量的混合物，并把分离所得的各组分逐个收集起来，得到高纯度的样品，称为高效液相制备色谱。

可见，制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。制备色谱的出现，使色谱技术与经济利益建立了联系。制备量大小和成本高低是制备色谱的两个重要指标。气相制备色谱主要用于石油化工产品和挥发性天然产物的色谱纯样品制备。表11.9.1仪器分析所需纯样品量

仪器样品量（mg）NMR1-10FT-IR0.1-1IR1UV-Vis<1元素分析1-10MS0.01-1全面鉴定一样品结构10-50分离度分析速度分离样品量思考：这三个指标是相互制约达的，不同分离目的有不同要求。请具体分析：

1）分离分析2）制备分离

评价制备色谱效率的主要指标是单位时间内分离纯物质的量，以纯组分量和该组分保留时间之比表示，定义为产率。另一指标是最大允许分离样品体积，它决定于固定相的负荷和色谱柱尺寸。塔板高度，mm容量因子

1E-51E-41E-31E-2

样品量图样品量对塔板高度和容量因子的影响表11.9.2制备色谱和分析色谱的比较

制备色谱分析色谱分离目的单位时间内获得符合纯度的物质量获得混合物中各组分的信息（定性定量）色谱模型非线性色谱线性色谱仪器设备制备柱、高流量、大进样、低检测（高通量）高压稳流、高精度进样、高灵敏检测（高重现性）

液相色谱制备纯物质的目的：结构鉴定，生物和毒理试验，以及某些珍贵或难分离单组分物质的生产。11.9.1制备色谱分离的一般考虑

任何制备分离的色谱模型都和分析分离的模型相类似。在制备色谱中，容量因子取决于样品量。如果柱子在超载的状态下工作，增加柱长比降低压力、增加柱效效果好。当然，制备色谱中的分离度比分析分离度更为重要。

当柱子在超载时，大量样品进入柱子，使得分离度、塔板数和容量因子随超载的状况而变化。在制备色谱过程中单位时间产量的提高可通过增加流速和增加柱子的载量来实现。图不同进样量时流速对分离度的影响流速，cm/secl

大颗粒（~50μm）大直径柱，在超载状态下完成相对大量的制备11.9.2制备色谱模型

在制备色谱中，为提高分离量，制备色谱一般是在非线性范围内运行。非线性色谱是制备色谱的理论基础，非线性色谱方程可以用一个浓度波的运动方程表示。制备色谱的溶质的保留时间：

可见，许多流行于分析型液相色谱的概念或参数在制备色谱中不太适用。使用这些结论容易被引入歧途。如：分离度、柱效柱和峰型的对称性在讨论制备色谱最佳化时往往很少考虑。制备色谱的三种运行模式主成分多组分微量组分超载有溶质超载和体积超载两种。溶质超载是指柱体积小，但样品浓度超过吸附等温线的线性范围，出现的峰型不对称，峰前沿陡峭而后部拖尾；体积超载是指进样体积比较大，样品浓度恒定，应限制在吸附等温线的线性范围内，洗脱的峰型高、对称或是个大平顶。制备条件的选择，包括上柱量、容量因子、选择性以及柱效。Knox和Pyper研究指出，分离纯化的基本参数是得到最大的选择性和高浓度的制备物质。在高浓度下，无论是溶质超载还是体积超载都保证了制备产量的提高。但体积超载要比溶质超载得到的产量低。高浓度的质量超载，在分离过程中避免了大体积引起的峰的扩张，在制备色谱中具有更大的优点。

制备色谱的进样体积：

对于k’=4，流出液组分浓度可达0.03%--0.3%，大小与α有关。

最大纯化产量与容量因子的关系分析分离增加分离度增大进样量超载条件11.9.3实验条件的选择

1）柱体积与填料

液-固色谱是制备色谱中常用的一种模式，而液-固色谱中流动相选择很重要。流动相首先应使制备组分有较大的溶解度，且容易从纯化后的组分中除去。一般小颗粒（5-10μm）用于高分离度的制备，粗颗粒（30-60μm）用于超载的高容量制备。样品容量的大小与填料的用量有关，而与颗粒度的关系不大。均匀的粗颗粒填料，多用于高样品量的制备。内径0.8-1.0cm，填有10μm颗粒度的填料的半制备柱，多用于重复分离和提纯产品的制备。

另一种类型的制备柱是径向压缩柱：内管采样塑料管，可自己装填规胶等填料。使用时，在管壁四周加压，大大减少了填料颗粒之间，以及填充床管与管壁之间空体积，从而提高了柱效。1）流动相对于非极性或中极性的有机合成产物，常用硅胶柱分离。流动相应首先用己烷和特丁基甲醚，后者作为极性改性剂调节溶剂极性，且不会生成过氧化物。如果要提高选择性和改变极性，用二氯甲烷比较合适。加压

1）样品前处理粗制品预先用抽提、蒸馏或重结晶等方法净化。合成产物一般用快速柱色谱粗分离。必要时，在制备色谱前加一保护柱，避免杂质损坏制备柱。2）纯组分的回收收集后的样品组分的有机溶剂一般用旋转蒸发方式除去；水分则采用冷冻干燥除去；流动相中的有机溶剂常用闪蒸方式回收。采用制备色谱得到的纯物质的主要杂质可能是流动相中的不溶物，如填料离解物。

11.9.4制备色谱仪l

输液能力达100mL/min，压力在200kg/cm2

左右l

进样器0.5~5mLl

检测器：“缩小光程和采用分流”，如0.2~0.5cm的UV池或RI测定l

馏分收集器：定时收集或定体积收集l

再循环阀和溶剂再生装置一般的分析型高效液相色谱仪可以换上内经在10mm的半制备柱完成一定的制备任务。11.9.5径向流动色谱色谱柱装填成一定厚度的圆筒形状，内外圆柱用两多孔滤膜固定。流动相及样品液从轴向进样口引入，径向通过进样管流向柱子外周，样品流过多孔滤膜后进入色谱床开始选择性分离，最后由内芯通道流出。与轴向流动相比，径向流动的进样面积很大；柱压降低；流量增大，有利于规模制备，特别是具有生理活性的大分子物质的分离提纯。但轴向流动柱的设备较复杂，价格更贵。样品液/溶剂流出液11.9.6应用举例

合成中的制备色谱条件选择一般应参考薄层色谱条件、快速柱色谱初分条件、分析柱色谱或小规模柱分离探索分离条件，再扩大到同类型的制备柱分离。如对复杂样品或未知样品的提取和纯化，通常采用分析柱探索分离条件，然后按规模放大分离。在一般情况下，制备色谱的分离度()应大于1.25，根据制备规模选择色谱柱，然后分析色谱的优化条件放大进样量、流速以及梯度条件等，最后在制备色谱中进行适当的调整。在合成反应中，常采用点板实验进行产物的鉴定。一般的说，比移值在0.2~0.8的化合物较适合于制备色谱。根据关系式可以估计制备色谱的流动相组成。考虑到薄层板可能含有粘合剂、荧光剂等，流动相的组成要进行适当的调整。

1）制备手性色谱拆分氧氟沙星光学异构体2）合成羟基吡咯烷类化合物的制备纯化3）高效液相制备分离抗氧剂1010加成反应副产物HPLC拆分氧氟沙星（氟哌酸）

国内使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已开发左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。用6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)OFLS-(-)-OFLR-(+)-OFL色谱新技术（结合文献调研自学）高速逆流色谱(High-speedCountercurrentChromatography,HSCCC)

连续逆流液液萃取:不用固态载体的液相分配色谱技术工作原理：一种独特的流体动力学现象一种连续的实用分离制备技术

HSCCC是由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种独特的不用固态载体的液相分配色谱技术,是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术。逆流色谱是一种基于连续逆流液液萃取的色谱型分离装置,它与不需要固相载体,只需要一个适宜的萃取分离体系。装有不相混溶两相液体的容器(转鼓)在一个力场中转动时会造成一个多级的混合澄清体系,被分离的溶质在流出液中通常会呈现各个分离的谱峰。

HSCCC螺旋管内区混合运动示意图

两相溶剂体系在高速旋转螺旋管内的运动分布：两相溶剂体系在螺旋管内存在两种状态（左图）,一种是在背离中心轴的螺旋管内,互不相溶的两相处于分离的位置,较重相(下相)处于螺旋管外侧,轻相(上相)处于螺旋管内侧。在朝向公转轴线的方向的区域两相激烈的接触、混合、分配和传递。随着流动相不断的注入流出,样品中分配系数小的组分先被洗脱出来,分配系数值较大的组分后被洗脱出来,最终达到分离的目的。

工作原理：利用的是螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合产生的一种独特的流体动力