实验三、血液葡萄糖的测定

实验七

血液葡萄糖的测定（福林-吴宪氏法）一、实验目的掌握无蛋白滤液的制备方法；掌握采用福林-吴宪氏法测定血液中葡萄糖的原理；进一步熟悉分光光度计的使用。吴宪的科学贡献吴宪的博士论文为基础的一系列工作，为现代临床血液化学分析提供了重要的分析手段，在国际上长时间被广泛采用。其中关于血糖测定的方法被国际上沿用长达70年，为此他被誉为国际血液分析的权威。在20世纪20年代以前，测验血中的非蛋白氮组分对病人来说是个沉重的负担，例如仅一次尿酸测定就需耗血25毫升。而福林—吴的新方法只需10毫升就足以进行包括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的测定（其中只需一滴血就能测定血糖）。二、实验原理磷钼酸钼蓝（蓝色）C6H12O6+2Cu(OH)2C5H11O5COOH+Cu2O↓3Cu2O+3H3PO4·2MoO3·12H2O6CuO+3H3PO4·Mo2O3·12H2ONa2CO3＋H2O＝NaOH+NaHCO3

NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4碱性铜试剂钼蓝溶液显蓝色，其蓝色的深浅与血滤液中葡萄糖的浓度成正比，选用颜色深浅较接近于测定管的标准管一同比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。血糖管的使用：血糖管下部的管径较细，以避免还原生成的氧化亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。钨酸法

原理：血液中的蛋白质在pH小于其等电点时，可用钨酸来沉淀。钨酸钠与硫酸混合产生钨酸和硫酸钠，游离的钨酸被，蛋白质吸附，形成不溶性的钨酸蛋白而沉淀，经过滤或离心，除去沉淀即得无蛋白的血滤液。试剂：①10%钨酸钠溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。仪器与器材：锥形瓶、吸管、奥氏吸管、滤纸、漏斗或离心管及离心机。方法与步骤：①取50ml锥形瓶1只，加入蒸馏水7份；②用奥氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，将吸管插人锥形瓶中水的底部，缓慢地放出血液。放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹人，反复洗管3次。充分混合，使红细胞完全溶解；③加入1/3mol／L硫酸溶液1份，随加随摇，充分混匀。此时血液由鲜红变成棕色，静置5～10min，使其酸化完全；④加入10％钨酸钠溶液1份，边加边摇，血液由透明变成凝块状。当振摇到不再产生泡沫为止；⑤放置数分钟后用定量滤纸过滤或离心除去沉淀，即得完全澄清的无蛋白血滤液，供测定用。用此法制得的无蛋白血滤液为10倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于全血0.ml，适用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的测定。三、实验步骤1、全血无蛋白滤液的制备抗凝血1ml蒸馏水7ml混匀1/3mol/L硫酸1ml振摇10%钨酸纳1ml振摇过滤放置5min无蛋白血滤液2、按表操作混匀，置沸水浴中煮8min。取出用流动自来水冷却3min无蛋白血滤液蒸馏水标准葡萄糖应用液碱性铜试剂空白管标准管测定管1.02.01.01.0---1.0-2.02.02.0血糖管试剂ml磷钼酸试剂2.02.02.01：4磷钼酸溶液加至混匀后放置2min12.512.512.53、比色测定将各管颠倒混匀后，用空白管调零，在420nm处测定吸收度。四、操作注意1、等水沸腾后，才能放入血糖管。加热要准确8分钟。2、冷却时切不可摇动血糖管，以免还原的氧化亚铜被空气中的氧再氧化，降低实际结果。3、加入磷钼酸后迅速比色。4、分光光度计的使用。五、结果计算测定管吸收度标准管吸收度葡萄糖（mg/100ml）×0.1

×1000.1

六、分析讨论=1、分光光度计的原理分光光度计是根据物质对光的选择性吸收来测量微量物质浓度的仪器，具有灵敏度、准确度高，操作方便、快速等特点。其工作原理为光的吸收定律（朗伯—比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时，其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律，即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。用公式表示为：T=I／I0

则A=lg（1／T）=Kbc

式中T—透光率

I—透过光强度

I0—入射光强度

A—吸光度

K—比例常数

b—溶液的厚度

c—溶液的浓度7200分光光度计分光光度计的组成

分光光度计种类很多，一般包括光源、单色器、吸收池、检测器和指示器五大部件组成。1.光源：是一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源光强度应大，有良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。2.单色器：

将来自光源的光按波长的长短顺序分散为单色光并能随意改变波长的一种分光部件，包括入口狭缝、色散元件、出口狭缝和准直镜四部分组成。3.吸收池：

又称为比色皿或比色杯等。常用吸收池是用无色透明、耐腐蚀的玻璃或石英材料制成，前者用于可见光区，后者用于紫外光区，吸收池光程0.1~10cm不等，其中以1cm为最多。4.检测器：检测器的作用是检测通过溶液后的光强度、并把光信号转变成电信号。常见的检测器有硒光电池、光电管和光电倍增管，后二者主要用于分光光度计。5.指示器：

常用仪器指示器有光点检流计、微安表、记录器和数字显示器等。光点检流计和微安表指示器的标尺上刻有百分透光度（T%）和吸光度A。

7200型分光光度计使用方法1．准备

在接通电源前，应对仪器的安全性进行检查，电源线、接线应牢固，接地线通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确。通电：指示灯亮，仪器自检，预热20min;用键设置测试方式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;放样顺序：打开样品室盖，在1~4号放置比色皿槽中，依次放入%T校具(黑体)，参比液，样品液1和样品液2.

¾容积光面对准光路手握毛面

7200型分光光度计的使用方法2．校正

校具(黑体)校“0.000”：将%T校具(黑体)置入光路，在T方式下按“%T”键，此时仪器自动校正后显示"0.000"

参比液校“100”%（T）或“0.000”（A）：将参比液拉入光路中，按“0A/100%T”键调0A/100%T，此时仪器显示“BLA”，表示仪器正在自动校正，校正完毕后显示“100”%T或“0.000”A后，表示校正完毕，可以进行样品测定。该模式下使空白试样透光率100%该模式下使空白试样吸光度为0.000拉动滑竿测定样品的吸光度3.测定

将两样品液分别拉入光路中,此时若在“T”方式下则可依次显示样品的透射比(透光度)若在“A”方式下，则显示测得的样品吸光度。

4．结束

测量完毕，关闭电源，将各调节旋钮恢复至初始位置。取出吸收池，维持其干净，不能有液体。比色皿洗净，晾干，存于专用盒内。5.注意事项：使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和100”。仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后用蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗.比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差.

比色皿不能单个调换预热是保证仪器准确稳定的重要步骤.比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器.

比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间拿放比色皿时,