天然药物分离技术及结构表征3-2

天然药物分离技术及结构表征一、经典分离技术

二、色谱分离技术

三、大孔树脂分离技术四、膜分离技术五、分子蒸馏技术

第三讲

植物化学成分的分离

一、大孔吸附树脂色谱的概念以大孔吸附树脂为吸附剂和分子筛应用的柱色谱分离形式为大孔吸附树脂色谱。二、大孔吸附树脂色谱原理大孔吸附树脂色谱是结合吸附性和分子筛性两种原理进行物质分离的。吸附性主要来源于范德华引力和氢键作用力，分子筛性来源于大孔树脂的多孔性结构产生的渗透和过滤作用。被分离的成分根据其分子的大小不同和吸附力的差异而分离。

第三章大孔树脂分离技术三、大孔吸附树脂色谱基本构成要素大孔吸附树脂的基本构成要素:有固定相、流动相以及被分离成分。1.固定相（1）种类分为非极性、中等极性、极性和强极性四类。（2）性质为大孔网状结构的高分子吸附剂，不溶于酸、碱及有机溶剂，在溶剂中体积会发生膨胀。（3）根据被分离成分的极性和分子大小来选择具有不同极性大小的大孔吸附树脂，以及决定大孔吸附树脂体积膨胀大小不同的溶剂。如分离大分子的物质选择能使大孔吸附树脂体积膨胀大的溶剂；反之，选用使其体积膨胀小的溶剂。

2.流动相（1）种类常用的有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）选用非极性大孔吸附树脂选择流动相的极性越小，洗脱能力越强；极性大孔吸附树脂选择流动相的极性越大，洗脱能力越强。四、大孔吸附树脂的类型

1.非极性吸附树脂：为苯乙烯(二乙烯苯聚合物，也称芳香族吸附剂。此类吸附树脂品种较多，如南开大学的上海试剂厂的2.中等极性吸附树脂：为聚丙烯酸酯型聚合物，以多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂，也称脂肪族吸附剂，如3.极性吸附树脂：含硫氧、酰胺等基团4.强极性吸附树脂：含氨基、吡啶、氧化氮等极性基团

国外大孔吸附树脂性能表五、大孔吸附树脂色谱的操作技术1.树脂预处理将新购树脂用丙酮加热回流提取以去除杂质，并用水和乙醇浸泡过夜待用的过程。2.装柱将浸泡过夜的树脂用湿法装柱，然后用95%的乙醇流洗柱床，至流出液与水混合无白色浑浊为止，再用去离子水洗至无醇味。3.药液的上柱吸附

(1)药液上柱前的预处理

。(2)泄漏曲线与吸附容量的考察

薄层检测斑点峰面积树脂吸附容量=泄露点前上柱样品体积（ml）X样品浓度（mg·L-1);(3)上柱工艺条件的筛选影响树脂吸附性能的因素有诸多方面，其中最基本的是树脂自身因素，包括树脂的骨架结构、功能基性质及其极性等。此外，样品pH值、浓度、吸附柱径高比及上样流速等条件均不同程度地影响树脂的吸附性能。①上样溶液的pH值上样溶液pH值对吸附和分离效果至关重要，根据化合物结构特点，灵活改变溶液pH值，可使提纯工作达到理想效果。不同pH值的吸附量和产品中黄酮含量比较

②药液浓度、流速及树脂柱径高比等因素也直接影响了大孔吸附树脂的吸附性能。4.树脂的解吸分离

由于树脂极性强弱不同，解吸分离时对洗脱剂极性大小的要求也不同。洗脱剂选择基本要求依据“相似相溶”原理。

(1)非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强；(2)对于中等极性大孔树脂和极性较大的化合物来说，则用极性较大的溶剂洗脱较为合适。洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，根据吸附力强弱选用不同的洗脱剂及浓度。实验研究具体操作方法为：解吸时，通常先用水，继而以醇-水洗脱，逐步加大醇的浓度，同时配合适当理化反应和薄层层析（如硅胶薄层层析、纸层析、聚酰胺薄层层析及HPLC等）作指导。解吸效果的评价：根据洗脱曲线，选择洗脱峰最集中的条件，如喜树碱用不同洗脱剂的洗脱曲线。5.树脂的再生

通常，当树脂使用一定周期后吸附能力要降低，或当树脂受污染严重时，均应强化再生。一般用无水乙醇或95%乙醇洗脱至无色后，树脂柱即已再生。然后用大量水洗去醇，可用于相同植物成分的分离。

若树脂颜色变深，可试用稀碱或稀酸溶液清洗，最后水洗至中性。

六、影响树脂纯化效果的因素及条件（1）树脂性质如前所述，树脂的理化性质对吸附效果的影响很大，一般要求树脂的吸附容量大、吸附速度快和机械强度好。由于树脂的孔度、孔径、比表面积及极性不同，故性质也不同，使用时必须根据情况加以选择。凡要吸附分子量小的物质，则选择比表面积高及孔径较小的吸附剂。（2）药液pH值由于pH值影响某些药物的解离度，亦即影响该化合物与溶剂的亲和力，从而影响到被大孔树脂吸附的难易程度。一般情况下，酸性物质应在酸性溶液中吸附，碱性物质在碱性溶液中吸附。（3）药液浓度大孔树脂的吸附量与药液浓度符合经典吸附式，即药液浓度增加，吸附量增加。但药液浓度增加有一定限度，即不能超过树脂的吸附容量。（4）溶剂被吸附的化合物在溶剂中的溶解度对吸附性能有一定的影响。通常，一种物质在某种溶剂中溶解度越大，树脂对该物质的吸附力就越小。如有机酸盐或生物碱盐在水中的溶解度很大，树脂对其吸附能力就弱。（5）上柱药液的温度上柱药液的温度升高，树脂的比上柱量下降，说明中药成分在树脂上的吸附过程为一放热反应。低温有利于树脂吸附容量的提高，温度太高会影响吸附效果，经实践证明，室温对试验几乎无影响，超过50℃时，吸附量明显下降，而在一定的温度范围内，上柱药液的温度越高，洗脱效果越好，故应注意上柱药液温度。（6）盐浓度无机盐的加入降低了吸附质在介质内的溶解度，从而有利于大孔树脂的吸附。有人通过静态吸附量的试验比较，认为无机盐的浓度为35g·L-1时，大孔树脂对人参总皂苷的吸附能力最强。（7）树脂柱径高比树脂柱内径与其柱高的比例也是影响树脂吸附效果的因素之一。合适的径高比可为分离提供较高的柱效，从而更有利于大孔树脂的吸附与分离。（8）树脂柱的清洗化合物经树脂吸附后在树脂表面或内部残留有许多非极性物质或吸附性杂质成分，必须在清洗过程中洗除，非吸附性成分一般用水即可洗除，而吸附性杂质根据情况可用一定浓度的酸液或碱液除去,一般情况下洗至近无色即可。（9）洗脱液的选择及解吸根据被吸附物的性质及吸附环境选择适宜的洗脱液进行洗脱和解吸。常用的方法是用低级醇、酮或其水溶液解吸，如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、水等。所选用的溶剂应符合两种要求：其一要求溶剂应能使大孔网状吸附剂溶胀，这样可减弱溶质与吸附剂之间的吸附力；其二则要求所选用的溶剂应容易溶解吸附物。因为解吸时不仅需克服吸附力，而且当溶剂分子扩散到吸附中心后，应能使溶质很快溶解。对弱酸性物质可用碱来解吸，对弱碱性物质则宜在酸性溶剂中解吸。吸附若在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸。【实例1】三棵针生物碱的提取【实例2】茶多酚提取分离工艺第四章膜分离技术第一节简介一、膜分离原理膜分离过程是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。膜分离技术有微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析等其中，反渗透、纳滤、超滤、微滤相当于过滤技术，用以分离含溶解的溶质或悬浮微粒的液体。与传统过滤的不同在于膜可以在分子范围内进行分离，溶剂或小分子溶质透过膜，颗粒、大分子溶质被膜截留。电渗析用的是荷电膜，在电场力的推动下，用以从水溶液中脱除离子，主要用于苦咸水的脱盐。纳滤适宜于分离相对分子质量在200、分子大小约为1nm的溶解组分，纳滤膜具有离子选择性，在生物技术工程中纳滤用来浓缩及脱盐，反渗透用于制水。二、膜的分类与特征膜就结构分为对称膜、非对称膜及复合膜。按其大小分为多孔膜、致密膜（无孔膜），多孔膜主要用于超滤、微滤和渗折过程；电中性的无孔膜主要用于反渗透、渗透汽化和气体渗透过程；而荷电的无孔膜则用于纳滤和电渗析过程。按材料分为有机膜与无机膜，有机膜主要为高分子化合物，应用最多最早的是纤维素类，另外有聚酰胺类、芳香杂环类、聚砜类、聚烯烃类、硅橡胶类、含氟高分子等；无机膜因其突出的特点（高热稳定性、耐化学侵蚀、无老化问题、使用寿命长、可反向冲洗等）受到了越来越多的重视，其中部分产品已在工业生产中应用。三、膜分离技术的特点①操作温度低，适用于热敏性物质的分离、分级、浓缩与富集。②无需外加其他物质，节约能源，保护环境。③选择性高，药效成分回收率和非药效成分去除率高。④分离与浓缩同时实现，浓缩率高。⑤适用范围广，不使用有机溶剂及化学处理，可保持中药方剂原方配伍的特点。⑥可实现自动化操作，易与其他过程偶合，装置和操作简单，周期短，易放大。⑦膜分离技术由于膜材料价格昂贵，生产成本较高，且生产中需要较大的压力设备，使其在工业中的应用受到一定限制。第二节膜分离技术用于中药有效部位提取的原理和依据

中草药的化学成分十分复杂，通常含有生物碱、氨基酸、有机酸、酚类、皂苷、甾体、萜类化合物以及蛋白质、黏液质、鞣质、糖类、淀粉、纤维素、无机盐等。其分子量的分布很宽，为几十至几百万道尔顿。部分中药中所含的主要成分的分子量范围第五章分子蒸馏技术分子蒸馏是在0.01-1.33Pa(1x10-4—1x10-2mmHg)的高真空下进行的一种特殊的蒸馏技术，在此条件下，蒸发面和冷凝面的间距小于或等于被分离物料的蒸气分子的平均自由程，所以又叫短程蒸馏。目前，该技术已被广泛应用于石油化工、食品香料等领域。本章将简要介绍分子蒸馏技术的原理、特点及其在中药和天然药物分离中的应用。第一节分子蒸馏的基本原理一、分子运动自由程分子碰撞：分子与分子之间存在着相互作用力。当两个分子离得较远时，分子之间的作用力表现为吸收力，但当两分子接近到一定程度后，分子之间的作用力会改变为排斥力，并随其接近程度的增加，排斥力迅速增加。当两分子接近到一定程度时，排斥力的作用使两分子分开，这种由接近而至排斥分离的过程就是分子的碰撞过程。

分子有效直径：分子在碰撞过程中，两分子质心的最短距离，即发生斥离的质心距离。

分子运动自由程：一个分子相邻两次分子碰撞之间所走的路程。二、分子运动平均自由程任一分子在运动过程中都在变化自由程，而在一定的外界条件下，不同物质的分子其自由程各不相同。就某一种分子来说，在某时间间隔内自由程的平均值称为平均自由程。由热力学原理可推导出：式中，λm是平均自由程；d是分子有效直径；p是分子所处环境压强；T是分子所处环境温度；k是波尔兹曼常数。三、分子蒸馏的基本原理根据分子运动理论，液体混合物的分子受热后运动会加剧，当接受到足够能量时，就会从液面逸出而成为气相分子。随着液面上方气相分子的增加，有一部分气体就会返回液体。在外界条件保持恒定情况下，最终会达到分子运动的动态平衡。根据分子平均自由程公式可知，不同种类的分子，由于其分子有效直径不同，故其平均自由程也不同，即从统计学观点看，不同种类分子逸出液面后不与其他分子碰撞的飞行距离是不相同的。分子蒸馏的分离作用就是利用液体分子受热会从液面逸出，而不同种类分子逸出后其平均自由程不同的这一性质来实现的。分子蒸馏技术的核心是分子蒸馏装置。为达到分离的目的，首先对液体混合物进行加热，能量足够的分子逸出液面，轻分子的平均自由程大，重分子的平均自由程小，若在离液面小于轻分子的平均自由程而大于重分子平均自由程处设置一捕集器，使得轻分子不断被捕集，从而破坏了轻分子的动态平衡而使混合液中的轻分子不断逸出，而重分子因达不到捕集器很快趋于动态平衡，不再从混合液中逸出，这样，液体混合物便达到了分离的目的。

第二节分子蒸馏技术的特点鉴于分子蒸馏在原理上根本区别于常规蒸馏，因而它具备许多常规蒸馏无法比拟的优点。（1）操作温度低:常规蒸馏是靠不同物质的沸点差进行分离，而分子蒸馏是靠不同物质分子运动自由程的差别进行分离，因此，后者是在远离（远低于）沸点下进行操作的。（2）蒸馏压强低:由于分子蒸馏装置独特的结构形式，其内部压强极小，可以获得很高的真空度。同时，由分子运动自由程公式可知，要想获得足够大的平均自由程，可以通过降低蒸馏压强来获得，一般为10-1Pa的数量级。从以上两点可知，尽管常规真空蒸馏也可采用较高的真空度，但由于其结构上的制约（特别是板式塔或填料塔），其阻力较分子蒸馏装置大得多，因而真空度上不去，加之在沸点以上操作，所以其操作温度比分子蒸馏高得多。如某液体混合物在真空蒸馏时的操作温度为260℃，而分子蒸馏仅为150℃。（3）受热时间短:鉴于分子蒸馏是基于不同物质分子运动自由程的差别而实行分离的，因而受加热面与冷凝面的间距要小于轻分子的运动自由程（即距离很短），这样由液面逸出的轻分子几乎未碰撞就到达冷凝面，所以受热时间很短。假定真空蒸馏受热时间为1h，则分子蒸馏仅用十几秒。（4）分离程度高:分子蒸馏常常用来分离常规蒸馏不易分开的物质，然而就两种方法均能分离的物质而言，分子蒸馏的分离程度更高。分子蒸馏的挥发度一般用下式表示：M1为轻组分分子量；M2为重组分分子量。而常规蒸馏的相对挥发度：在ρ1/ρ2相同的情况下，重组分的分子量M2比轻组分的分子量M1大，所以αr比α大。这就表明分子蒸馏较常规蒸馏更易分离，且M1、M2的差别越大则分离程度越高。（5）不可逆性普通蒸馏是蒸发与冷凝的可逆过程，液相和气相间可以形成互相平衡状态。而分子蒸馏过程中，从蒸发表面逸出的分子直接飞射到冷凝面上，中间不与其他分子发生碰撞，理论上没有返回蒸发面的可能性，所以，分子蒸馏是不可逆的。

（6）没有沸腾、鼓泡现象普通蒸馏有鼓泡、沸腾现象，分子蒸馏是液层表面上的自由蒸发，在低压力下进行，液体中无溶解的空气，因此在蒸馏过程中不能使整个液体沸腾，没有鼓泡现象。（7）可进行多级分子蒸馏对于较为复杂的混合物的分离提纯，可进行多级分子蒸馏，产率较高。（8）与其他新技术联用分子蒸馏设备可与超临界流体萃取技术和膜分离技术联合应用。第三节分子蒸馏设备完整的分子蒸馏系统主要包括：脱气系统、进料系统、分子蒸馏器、加热系统、真空冷却系统、接收系统和控制系统。1—变速机组；2—刷膜蒸发器缸；3—重组分接收瓶；4—轻组分接收瓶；5—恒温水泵；6—导热油炉；7—旋转真空计；8—液氮冷阱；9—油扩散泵；10—导热油控温计；11—热油泵；12—前级真空泵；13—刮膜转子；14—进料阀；15—原料瓶；16—冷凝柱。分子蒸馏器是整个分子蒸馏系统的核心部分，在分子蒸馏过程中起着决定作用。

第五节分子蒸馏技术在中药和天然药物中的应用一、应用优势