流式细胞术的应用(高艳红)

流式细胞术的应用

（FlowCytometry,FCM)解放军总医院生化科高艳红1、流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。基本概念EPICSXL流式细胞仪电源箱自动进样器流式细胞仪主机流式细胞仪工作站流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的应用流式细胞仪的操作内容流式细胞仪结构

流动室及液流驱动系统:鞘液激光光源及光束形成系统:透镜、滤光片、小孔，聚焦光源光电管和检测系统：收集不同波长的荧光信号，光电倍增管（PMT）、补偿电路，荧光信号转换为电信号，并将信号放大计算机和分析系统流式细胞仪的主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：

一般流式细胞仪每秒检测1000～

5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

流动室（flowcell）InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid光路激光 根据被激发物质的激发光谱而定

滤片长通滤片

–

允许长于设定波长的光通过短通滤片–

允许短于设定波长的光通过带通滤片–

允许一定带宽的波长的光通过带阻滤片–

阻挡一定带宽的波长的光通过二向色性滤片(dichroicfilter)：当以45o

角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光。

常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC633 670PMTPMTPMTPMT4DichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryPrincipleLaser1234Flowcell检测信号散射光信号

FS:前向角散射光

SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片

散射光信号—前向散射光(FS)FSForward(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FS的强度主要与细胞或其他颗粒的大小有关FALSSensorLaser前向散射光

散射光信号–侧向散射光SS-Side(AngelLight)Scatter

与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SS反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，SS的强度与细胞或其他颗粒的颗粒度有关FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光荧光染料比较(平均荧光强度)

Q-Prep/ImmunoPrep试剂系统PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC

二、流式细胞术的应用细胞增殖周期测定和DNA倍体分析凋亡检测免疫功能的检测血液学应用HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎其他：溶液中细胞因子的测量细胞分选

细胞增殖周期测定和DNA倍体分析1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。具有2CDNA含量细胞为G0/G1期细胞，4CDNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴细胞作为对照。正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。凋亡检测1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。2）DNA链损伤“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI双染法4）线粒体细胞膜电位的检测5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法检测基因免疫功能的检测（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚群进行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细胞），CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：naïve辅助/诱导T细胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：记忆性辅助/诱导T细胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤；CD3+/CD8/45RA+：naïve抑制/杀伤T细胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。胞内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞，CD4+/IFN-γ+。（2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在WHO和国际免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群.白细胞分化抗原-CD分子(Clusterofdifferentiation)

CD抗原及其相关细胞群

细胞群CD抗原

T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75

髓系细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细胞CD16CD56CD57CD94

血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63

激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97

粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f

内皮细胞CD105CD106CD109细胞因子受体CD25CD115CD117CD122CD126

1.评价机体的免疫功能(1)淋巴细胞亚群

T细胞：CD3+CD4+(Th/Ti)CD8+(Ts/Tc)B细胞：CD19+NK细胞：CD3-CD16+CD56+(2)淋巴细胞亚群细分

T细胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+Ti：CD4+CD45RA+B细胞：B1：CD5+CD19＋B2：CD5－

CD19+

CD4+:Th1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFNr+IL4+

CD8+:Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFNr+IL4+根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同分为辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、自身免疫病、过敏症、排斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th2细胞平衡偏提供正确的治疗依据。

(3)活化淋巴细胞亚群

活化总T细胞：

CD3+/HLA—DR+

早期活化T细胞（CD4/CD69/CD8）

活化T细胞（CD25/CD3）

活化T细胞亚群（CD4/CD25/CD8）

或（CD4/HLA-DR/CD8）HLA-DR、CD69、CD25是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗(8)机体免疫功能监测的应用自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊柱炎相 关标志变态反应性疾病CD23:与变态反应严重程度 呈正相关免疫缺陷性疾病感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染)

免疫治疗监测肿瘤免疫监测移植免疫监测HLA-B27检测的临床意义强直性脊柱炎阳性率90%以上

Reiter’s综合症70-90%

银屑病性关节炎50-60%

葡萄膜炎40-50%

普通人群5-10%FCM在临床血液学中的应用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋巴瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M）、免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）：FITC（异硫氰酸荧光素，Fluorescein

isothiocyanate），FL2：PE（藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白，peridininchlorophyllprotein），FL4：APC（别藻兰蛋白allophycocyanin,）

能正确区别AML和ALL，并能进一步区别

ALL中的T系和B系及亚型。能正确鉴别AML中的M0、M6、M7

诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病(如毛细胞性白血病)免疫分型的价值白血病免疫分型诊断标准 (EGIL)标准B淋巴系白血病Pro-B-ALL(BⅠ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+CommonALL(BⅡ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CD10+Pre-B-ALL(BⅢ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CyIgM+成熟-B-ALL(BⅣ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，Kappa/Lambda+急性髓性白血病(AML)AML中，M0M6M7可以通过免疫分型确诊诊断白血病主要标志：B-ALL: CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL: CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML: CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO

M3:CD34-,HLA-DR- M2:CD19+:t(8,21) M4/M5:CD14+ M6:GlyA+,CD71+ M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测。3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出现活化的血小板增多。而血小板减少的患者，如果出现网织血小板增多，则说明血小板减少的原因为血小板破坏过多所致。4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH诊断的主要为CD55和CD59两种，如果在红细胞或WBC上出现CD55或/和CD59的减少，可诊断为PNH。5）网织红细胞计数6）白细胞分类计数2.白血病的耐药基因(MDR)检测

MDR表达产物—P糖蛋白(P-gp)P-gp的作用机理

P-gp在白血病检测中的临床意义3.白血病的其它检查(1)细胞凋亡的检查

Fas及FasLApo2·7bcl-2P53

AnnexinⅤ

Caspase(半胱氨酸蛋白酶)(2)细胞DNA分析(3)白血病残留病灶检查(MRD)细胞分选

FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以上。除细胞分选外还可进行染色体分选。分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可用于基因诊断。三、操作方案PROTOCOL选定参数构建直方图区域，GATE，阈值，电压和增益，补偿条件。FCM的主要测定指标FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中：

FSC：反映细胞的大小

SSC：反映细胞内颗粒性FCM标记方法单标：一种单抗/tube:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：（两种单抗/tube）：FL1,FL1,FSC,SSC（四参数）三/四标：（三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC荧光素种类FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nmPE（藻红蛋白）：橙黄色575nmPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 488nm波长的氩离子激光激发APC(别藻兰蛋白）：红色660nm630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发

PE最强，适用于弱表达抗原

FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广

biotin-avidin不适合弱抗原的检测抗体的选择数据显示方式单参数直方图双参数二维点图等高图二维密度图三维图流式常见图形(HistogramPlot)适用于：单参数分析流式常见图形(DotPlot)适用于：多参数分析抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子