第二章 色谱法原理

第二章色谱法的原理

（PrinciplesofChromatography）

第一节色谱分析的基本原理一、色谱分离的本质分配系数的差异是所有色谱分离的实质性原因分配系数K是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即

K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm

Cs

和Cm的单位是g/ml容量因子k容量因子又称分配比，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即

k=组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量=p/q容量因子k值可直接从色谱图中测得。k=(tR–tM)/tM

=tR/tM

=VR/V0

k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。

3.分配系数K与容量因子k

的关系

k=CsVS/CmVm

=KVS/VM=K/(=VM/VS)K=k·

在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。其中β称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6-35；对毛细管柱，其β值为60-600。1、塔板理论的导出始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。二、色谱分离的塔板理论板式精馏塔

塔板理论的导出将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，引用了处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱过程。把色谱柱比作一个分馏塔，色谱柱可由许多假想的塔板组成（既色谱柱可分成许多小段），在每一小段（塔板）内，一部分空间为涂在担体上的液相占据，另一部分空间充满着载气（气相），载气占据的空间称为板体积△V。当欲分离的组分随载气进入色谱柱后，就在两相间进行分配。

由于流动相在不停地移动，组分就在这些塔板间隔的气液两相间不断地达到分配平衡。△V（除去固定相，称为板体积）塔板数（柱长）LH塔板高度塔板理论假定：⑴在这样一小段间隔内，气相平均组成与液相平均组成可以很快达到分配平衡，这样达到分配平衡的一小段柱长，称为理论塔板高度H.⑵载气进入色谱柱，不是连续而是脉动式的，每次进气为一个板体积。⑶试样开始时都加在第0号塔板上，且试样沿色谱柱方向的（纵向扩散）扩散可略而不计。⑷分配系数和分配比在各塔板上是常数。

为简单起见，设色谱柱由5块塔板（n=5，n为柱子的塔板数)组成，并以r表示塔板编号，r等于0，1，2，…，n—1，某组分的容量因子k=1,则根据上述假定，在色谱分离过程中该组分的分布可计算如下：

开始时，若有单位质量，即m=l(1mg或1μg)的该组分加到第0号塔板上，分配达平衡后，由于k=l，即p=q，故p=q=0.5.

当一个板体积(1△v)的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有q部分组分的载气顶到1号板上,此时0号板液相中p部分组分及1号板气相中的q部分组分，将各自在两相间重新分配，故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液两相各为0.25，而1号板上所含总量同样为0.5，气液两相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次，如下所示：塔板号r0123进样q0.5p0.5进气1△Vq0.250.25p0.250.25进气2△Vq0.1250.125+0.1250.125p0.1250.125+0.1250.125进气3△Vq0.0630.063+0.1250.125+0.0630.063p0.0630.125+0.0630.063+0.1250.063

按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动式进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量(气相、液相总质量)见下表。012345n=01234567891011121314151610.50.250.1250.0630.0320.0160.0080.0040.0020.00100000000.50.50.3750.250.1570.0950.0560.0320.0180.0100.0050.0020.001000000.250.3750.3750.3130.2350.1650.1110.0720.0450.0280.0160.0100.0050.0020.0010000.1250.250.3130.3130.2740.220.1660.0940.0700.0490.0330.0220.0140.00800000.0630.1570.2350.2740.2740.2470.2070.1510.1100.080.0570.0400.027000000.0320.0790.1180.1380.1380.1240.1040.0760.0560.0400.0280.020载体板体积数Nr由表中数据可见，当进气量N=5时，即5个板体积载气进入柱子后，组分就开始在柱出口出现，进入检测器产生讯号(见下图，图中纵坐标x为组分在柱出口出现的分数）。n0.150.100.055图7-4组分从n=5柱中流出曲线图为组分在柱出口的分数x

由图7-4可以看出，组分从具有5块塔板的柱中冲洗出来的最大浓度是在N为8和9时。流出曲线呈峰形但不对称。这是由于柱子的塔板数太少的缘故。经多次分配后的浓度分布

当n>50时，就可以得到对称的峰形曲线。在气相色谱中，n值是很大的，约为103~105，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。这样，溶质在气液两相的分配方式符合数学上的“二次项分配”，从二次项分配可以导出流出曲线的数学表达式C——色谱流出曲线上任意一点的浓度N——理论塔板数M——溶质的质量VR——溶质保留体积V——在色谱流出曲线上任意一点的保留体积

式中co为进样浓度，tR为保留时间，σ为标准偏差，c为时间t时的浓度，此式称为流出曲线方程式。

以上讨论单一组分在色谱柱中的分配过程。流出曲线上的浓度c与时间t的关系可由下式示：2、有两个物质在色谱柱中的分配及流出曲线假如有A,B两个物质A的K=1/3B的K=3色谱柱固定相和流动相体积相同两个物质经过色谱柱之后的流出曲线如图：分配系数为0.33及3.00的A、B二组分经多次分配的结果

若试样为多组分混合物，则经过很多次的分配平衡后，如果各组分的分配系数有差异，则在柱口处出现最大浓度时所需的载气板体积亦将不同，由于色谱柱的塔板数相当多，因此分配系数有微小差异，仍可获得好的分离效果。

色谱峰→窄，塔板数n→多，理论塔板高→小，柱效能→高。因而n或h作为描述柱效能的一个指标。由塔板理论可导出n与色谱峰峰底宽度的关系：

式中L为色谱柱的长度，tR及W1/2或W用同一单位（时间，距离）。表示色谱柱的效能指标①

tR，W1/2，W单位统一②对应的组分（标明物质）③L改变则n有效改变，对H有效无影响。

塔板理论在解释流出曲线的形状，浓度极大点位置以及计算评价柱效能等方面取得了成功。第二节色谱法中常用的术语和参数一、气相色谱法中常用的术语和参数

1、典型的色谱图下图是使用热导池检测器，往色谱仪中注入带有少量空气时，得到的色谱图（二）基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。色谱图（无铅汽油）农药碳酸饮料

2、区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

Y1/2=2.3543.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是Y=43、保留值

1.死时间tM

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM

因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算，即

ū=L/tM2.死体积VM

指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。

VM=tMFco

式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。3、死区域VG

色谱柱中不被固定相占据的空间4.保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。信号进样tR5.调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tR

tM

由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。

保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。6.保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：

VR=tRFco

7.调整保留体积VR

某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。

VR=VR

V0=tRFco

8、净保留体积VN经过压力修正的调整保留体积

VN

=jVR

j为色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数

Pi——色谱柱进口压力P0——色谱柱出口压力9、比保留体积Vg把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积VL——固定液体积ρL——固定液密度ρLVL——固定液质量10.相对保留值r2,1

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。

r2,1=2/tR1´=VR2/VR1

由于相tR对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。

在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即

=tR(i)/tR(s)

式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。11、保留指数（I）1958年由克瓦茨（Kovats

）提出，用来表示化合物在一定温度下在某种固定液上的相对保留值。保留指数

人为规定正构烷烃的保留指数为其碳数乘100,如正己烷和正辛烷的保留指数分别为600和800。至于其他物质的保留指数，则可采用两个相邻正构烷烃保留指数进行标定。测定时，将碳数为n和n+1的正构烷烃加于样品x中进行分析，若测得它们的调整保留时间分别为tr′（Cn），tr′（Cn+1；）和tr′（x）且tr′（Cn）＜tr′（x）＜tr（Cn+1）时，则组分X的保留指数可按下式计算，即12、保留指数差（ΔI

）化合物X在某一固定液S上测得的保留指数Ixs减去X在角鲨烷固定液上得到的保留指数IxsqΔIxs=Ixs-Ixsq4、色谱柱的柱效率和分离度（1）柱效率柱效率—溶质通过色谱柱之后其区域宽度的增大幅度。溶剂效率—两个物质在固定相上的相对保留值的大小。（2）理论塔板数(n)的计算和测定(3)有效理论塔板数（neff）消除色谱柱中死体积对柱效的影响（4）溶剂效率固定相对某两个混合物分离能力的表征即α2,1=ti/ts´=Vi/Vs=Ki/Ks5、分离度

分离度R，是一个综合性指标。分离度是既能反映柱效率又能反映溶剂效率的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，(1)分离度(R)

它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即

R=2(tR2-tR1)/W1+W2

(2)半峰宽分离度（R1/2）R1/2=2(tR2-tR1)/W1/2（1）

+W1/2（2）（3）峰高分离度（Rh）当一对物质分离较差时，可以用峰高分离度表示

Rh=(hI-hM)/hI

R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R<1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。

通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。6、各色谱参数之间的关系（1）保留时间和容量因子之间的关系

tR

=tM(1+k)=L/ū(1+k)

k=tR'/tM

(2)分离度R=（

n/4）（α-1/α）（k/1+k）上式即为基本色谱分离方程式。

基本的色谱方程的表达式

在实际应用中，往往用neff代替n处理上式可得

可以看出，后者为基本色谱分离方程式又一表达式。

二、液相色谱中常用术语和参数1、色谱图和保留值（1）粒间体积（V0）色谱柱填充剂颗粒间隙中流动相所占有的体积（2）（多孔填充剂）孔体积（Vp）色谱柱中多孔填充剂所有孔洞中流动相所占有的体积（3）柱外体积（Vext）从进样系统到检测器之间色谱柱外的液路部分中流动相所占有的体积（4）液体总体积（Vtot）Vtot=V0+VP+Vext

（5）淋洗（洗脱）体积（Ve）从进样开始计算的通过色谱柱的实际淋洗体积（6）流体力学体积（Vh）每摩尔高分子化合物在溶液中运动时所占的体积，与相对分子量和特性粘度的乘积成正比2、和柱效能有关的参数（1）折合板高（hr）折合成固定相单位粒径的理论板高

hr

=H/dp（2）折合流动相速度（vr）

vr

=udp/Dm1956年荷兰学者vanDeemter（范第姆特）等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。第三节色谱的速率理论

vanDeemter方程的数学简化式为

H=A+B/u+Cu式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。一、气相色谱速率理论（1）.涡流扩散项

A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。

涡流扩散示意图初始带宽最终带宽

由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：

A=2λdp

上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A=0。（2）.分子扩散项B/u（纵向扩散项）纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为B=2γDg（a）柱内谱带构型（b）相应的响应信号B/u（纵向分子扩散项）——指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽B=2γDg式中：γ——弯曲因子，填充柱γ

<1

空心柱γ=1Dg——组分在流动相中的扩散系数

由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。

γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数（cm3·s-1）,分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dg成正比.

T——绝对温度MA,MB——气体摩尔质量P——总压力VA.VB——气体摩尔体积Dg与流动相及组分性质有关：

(a)

相对分子质量大的组分Dg小，Dg反比于流动相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较大的流动相，可使B项降低；

(b)Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。

另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。（3）.传质阻力项Cu传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项，即

C=Cg+C1

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；