第二章 发酵工业菌种改良1

第四节发酵工业菌种改良菌种改良技术的进步是发酵工业发展的技术支撑。所以，育种工作者的任务就是在不损及微生物基本生命活动的前提下，采用物理、化学或者生物学以及各种工程学的方法，改变微生物的遗传结构，打破原有的代谢机制，使之成为“浪费型”菌株。同时，按照人们的需要和设计安排，进行目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。目的提高生产能力提高产品质量开发新产品解决生产实际问题防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、DNAShuffling等一、基因突变突变：指生物体的表型发生的可遗传的变化。狭义突变：基因突变—点突变广义突变：基因突变和染色体畸变突变的几率：10-6---10-9

野生菌株---突变-----突变株选择性突变

非选择型突变（一）基因突变类型（表型分类）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）营养缺陷型（株）抗性突变型（株）条件致死突变（株）营养缺陷型——因突变而丧失合成某种物质的能力，因此必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的突变株。条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变（二）突变率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。（三）基因突变的特点以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：正向突变率=回复突变率（四）基因突变的机制自发突变诱发突变二、突变与育种（一）自发突变与育种1、生产中育种10-6突变率---寻找正向突变菌株2、定向培育优良菌种牛型结核杆菌------13年----230代----卡介苗（减毒活菌疫苗）（二）诱变育种诱变+筛选诱变是随机的；筛选是定向的目前发酵工业生产菌株都是经过突变改造过的。1、诱变育种的基本规律2、诱变育种中的几个原则诱变剂的选择诱变基本过程诱变剂剂量的选择诱变剂的处理方法突变株的筛选（1）诱变剂的选择诱变剂作用的普遍性：在其它菌种选育中诱变效果好的诱变剂。如：UV亚硝基胍（NTG），快中子诱变剂的特异性：经验之谈

四环素族抗生素用亚硝酸、羟胺，青霉素用氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍．菌株的差异：（即使是同一菌）

A：遗传性不稳定的菌株------用缓和诱变剂B：遗传性稳定的菌株-----首用强，后用缓。考虑诱变机制：

UV嘧啶，亚硝酸嘌呤，因此复合用为好（2）诱变基本过程选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验出发菌株的选择出发菌株应具备①对诱变剂的敏感性高；②具有特定性状的生产能力◆出发菌株的来源①自然界分离到的野生型菌株：②历经生产考验的菌株：③已经历多次育种处理的菌株：制备单细胞或单孢子悬液要求

①菌体处于对数生长期，

②细胞分散且为单细胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：物理诱变剂——生理盐水

化学诱变剂——缓冲液

浓度：细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml（3）诱变剂剂量的选择用50—85%的杀菌剂量，此时正突变率高，特别是出发菌株已是高产菌株诱变剂的剂量对产量变异影响的可能结果a.未经诱变剂处理；b.变异幅度扩大，但正负突变相等；c.正突变占优势；d.负突变占优势（4）诱变剂的处理方法诱变剂使用方式

单一处理

复合处理

诱变处理条件：温度（生长温度）

PH（缓冲剂）处理时间诱变作用的终止：用解毒剂、用水稀释（5）突变株的筛选筛选条件：基因型+环境=表型表型迟延充分表达分离性迟延现象生理性迟延现象（5）突变株的筛选合适的筛选方法：平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法摇瓶培养法第一轮：一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株→→→选出5株诱变处理初筛

（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：5个出发菌株→→→→→→选出50株→→→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）3、三类突变株的筛选产量突变株筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型的筛选

（1）产量突变株筛选琼脂块培养法（春日霉素）孢子悬液------诱变----适当培养（表型迟）-涂布平板----打孔取菌落-----琼脂块培养4-5天—测定琼脂块所含的抗生素的抑菌圈----效价高菌（2）抗药性突变株的筛选（梯度平板法）抗药性突变株的应用：*作为菌株的遗传标记*作为生产菌种

（结构类似物抗性突变株）如“吡哆醇高产菌株的筛选”（3）营养缺陷型(auxotroph)的筛选A：有关的三类遗传型个体：营养缺陷型突变株：野生型菌株：原养型菌株：B有关的三类培养基基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。

补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。C营养缺陷型的筛选步骤C-1：诱变处理（同前讲述）C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）C-3：检出缺陷型

C-4：鉴定缺陷型C-2：淘汰野生型（浓缩缺陷型）（1）抗生素法野生型菌株在MM上生长+青霉素—杀死Ｇ＋缺陷型菌株在MM上不生长＋青霉素—-不杀死制霉菌素法则适合于真菌抗生素处理完后，离心收集细胞，并转入低渗溶液（2）菌丝过滤法适于：丝状（放线菌、霉菌）原理：野生型基本培养基上发育成菌丝；缺陷型孢子不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。C-3:检出缺陷型逐个检出法影印检出法夹层培养法限量补给法逐个检出法

影印检出法夹层培养法限量补给法在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培养,大菌落为野生型小菌落的为缺陷型。C-4:鉴定缺陷型生长谱法组合营养物法组合补充培养基法生长谱法斜面菌种-----生理盐水洗下细胞------洗涤-----涂布（105个/皿）纸片1:氨基酸混合液;纸片2:维生素混合液;纸片3:核酸水解液;纸片4:酵母水解液组合营养物法：A将多种营养因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；一组：1

2345

二组：26

789

三组：3710

1112

四组：4811

1314

五组：59121415一组：1

2345

二组：26

789

三组：37