2023年细胞工程实验指导重庆邮电大学主

细胞工程实验指导

目录TＯＣ＼o"1-3"\ｈ\ｚ\uＨYPERLINＫ实验室安全守则ﻩＰAGEREF_Ｔoc\h３ＨYPＥRＬＩNK\l"_Ｔoc"实验操作须知 PＡGEＲＥＦ_Toc\h5ＨYPＥRＬIＮK\l＂_Ｔoc"实验一培养基母液的制备 PAＧERＥF_Toｃ\h8ＨＹＰＥＲLＩNK＼l"_Ｔoc"实验二培养基的配制与灭菌ﻩPAGEＲEF_Toc＼h12HYＰEＲLINK＼l＂＿Toc"实验三培养材料灭菌和接种 PAGERＥＦ_Toc\h16HＹPERLINK\ｌ"_Ｔoc＂实验四愈伤组织的诱导与增殖 ＰＡGERＥF＿Tｏc\h1９ＨＹＰERLINＫ＼l"_Toc"实验五愈伤组织的分化 PAＧEＲＥＦ_Toc\h２1HYPERLINＫ实验六植物细胞悬浮培养与同步化 PＡＧERＥＦ_Toｃ\h22ＨYPERLINK\l＂＿Toｃ＂实验七细胞微室培养 PAGERＥＦ_Ｔｏc\ｈ２3实验八原生质体培养 PAGERＥF_Toｃ\ｈ２4HYPＥＲＬINK实验九烟草原生质体融合ﻩPAGERＥF_Tｏc\h26HYＰERLIＮK＼l"_Toｃ"实验十烟草叶片组织培养 PAGEREF_Toｃ\h２8ＨYPEＲＬINK＼ｌ"＿Tｏc"实验十一月季组织培养ﻩPＡGEREF_Tｏc\ｈ29HＹPEＲLIＮK\l＂_Toc"实验十二菊花组织培养与快速繁殖ﻩＰAGEREF＿Toc\ｈ3０HＹPＥＲLINＫ\l"_Toc"实验十三马铃薯茎尖脱毒 ＰＡＧEＲEＦ_Toc\h32HYPＥRＬINK\ｌ"＿Ｔoc＂实验十四马铃薯试管微薯的诱导ﻩPAGERＥF_Toc＼h33ＨYPEＲLＩＮＫ实验十五小麦幼胚培养ﻩPAGＥＲEF＿Tｏｃ\h３4HYＰEＲLＩNK\l＂_Tｏc"实验十六小麦成熟胚培养ﻩＰAGEREF_Toc\h3６HYＰEＲLＩＮＫ\ｌ＂_Tｏc"实验十七小麦花药培养ﻩPＡＧEREF_Toｃ＼h3８HYPERLIＮK＼l"_Toｃ＂实验十八生物反映器中芹菜体胚发生的大规模培养ﻩＰAGEＲＥF_Ｔoc\h39HYＰERLＩＮK\l＂_Ｔoc"实验十九植物细胞的生长计量技术 ＼h41HYPＥRＬINＫ实验二十烟草遗传转化实验 PＡGERＥＦ_Tｏc＼h4５HYPERLINK＼l＂_Toc"实验二十一细胞原代培养ﻩPAＧEＲEF_Toc\ｈ46HYPＥRLINK\l＂_Toc＂实验二十二细胞传代培养 PAＧEREＦ_Ｔoc＼h48HYPERＬIＮK＼l"_Ｔｏc"实验二十三细胞的冻存和复苏 PＡGEREF_Toc＼ｈ49ＨＹPERＬINＫ实验二十五细胞周期的测定ﻩPＡGEＲEＦ_Tｏc\h52ﻬ实验室安全守则一般规定１、上课第一天请先熟悉环境,察看紧急冲洗站、洗眼站、灭火器、急救箱及安全梯等的位置,牢记“安全”是进行任何实验最重要的准则。2、在实验室內请穿着实验服，避免穿凉鞋、拖鞋。留有长发者，戴帽套将头发捲入套內,或以橡皮筋束于后，以防止引火危险或污染实验。3、在实验室内严禁吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑,食物饮料勿存放于实验室的冰箱中,实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服及杂物等。4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有,不得带出实验室。每组分派的仪器、耗材请拟定清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用，实验前后,请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境卫生。5、实验前详阅实验内容,了解实验细节的原理及操作规程，注意上课所告知的注意事项。实验进行中有任何状况或疑问,随时发问,切勿私自变更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时,请随即清理。实验后，确牢记下自己的结果，严禁抄袭,拟定关闭不用的电源、水、酒精灯及煤气等。６、睡眠局限性、精神不济或注意力无法集中,请立即停止实验。实验时间若延长,请注意时间的管制及自身的安全,不可自行逗留实验室过夜。７、实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及电源，离开实验室前记得洗手。8、任何意外事件应立即报告师长,并应熟知相关的应急措施。药品1、使用任何药品,请先看清楚标示、注意事项，翻阅物质安全资料表,查明是否对人体导致伤害,使用完毕请放回原位。２、新配制的试剂请清楚注明内溶物、浓度、注意事事项及配制日期，为避免污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。３、挥发性、腐蚀性、有毒溶剂(如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、ｂ-mercaｐｔoethanol、酚等）要在通风橱中戴手套量取配制,取用完后随即盖好盖子，若不小心打翻试剂,立即解决。4、有毒、致癌药剂例如ａｃrｙlamide（神经毒)、eｔhidiumbrｏmide(突变剂）、ＳDS、秋水仙素请戴手套及口罩取用，并勿到处污染,脱下手套后,应养成洗手的好习惯。5、接触到病原材料或细菌,应迅速消毒。所有被污染的物品，在丢弃或反复使用前均需先灭菌,固体培养基不得倒入水槽或下水道中。6、使用刻度吸管取物时,切勿用嘴吸取，请用自动吸管或安全吸球。仪器1、使用仪器前先了解其性能、配置及对的操作方法，零件及附件严禁拆卸,勿私自调整，并注意插座电压（110V或22０V）之类别。2、使用离心机时,离心管要两两对称、重量平衡，锁紧离心机转陀。冷冻离心机于开机状态时,务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。3、实验时不要用潮湿有汗的手去操作电器，不要用手紧握也许荷电的电器,不应以两手同时触及电器,电器设备外壳均应接地。万一不慎发生触电事故，应立即切断电源开关,对触电者采用急救措施。4、使用微波炉加热时，不可有铝箔等金属物品,瓶盖必须松开，以免爆炸。加热后戴防热手套取出瓶子。５、使用UV灯时,不要以眼睛直视ＵV,应隔着挡板观测，完毕立即关灯。6、超净工作台內的酒精有机溶剂及易燃物(如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离火苗，不可留置火焰燃烧，万一着火,应力持镇定，沉着解决。酒精或乙醚等着火时,应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖,勿使用水冲洗。7、使用震荡器震荡培养时,注意三角瓶务必对称放置，并用橡皮筋等夹紧,勿使其摇摆摔出台面,否则需拆开并清除玻璃碎片与培养液。急救措施1、急性呼吸系统中毒:应使中毒者迅速离开现场，移到通风良好的地方，呼吸新鲜空气。如有休克、虚脱或心肺机能不全，必须先作抗休克解决，如人工呼吸、给予氧气、喝兴奋剂(如浓茶,咖啡）等。2、经由口服而中毒：需立即用3-5%小苏打溶液或１:５0０0高锰酸钾溶液洗胃，洗胃时要大量地喝，边喝边使之呕吐，最简朴的催吐办法是用手指或筷子压舌根，或给中毒者喝少量（1５-25毫升)１%硫酸铜或硫酸锌溶液（催吐剂)。使之迅速将毒物吐出。洗胃要反复进行多次,直至吐出物中基本无毒物为止。再服解毒剂，一般解毒剂有鸡蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等。此外有些特殊解毒剂专对某种中毒而用。如磷中毒时用硫酸铜，钡中毒时用硫酸钠，氰化物中毒时用硫代硫酸钠等。3、皮肤、眼、鼻、咽喉受毒物侵害时,应立即用大量自来水冲洗,然后送医院请各专科医生解决。４、一度烧伤：只损伤表皮，皮肤呈红斑，微痛，微肿，无水泡。如被化学药品烧伤,应立即用大量水冲洗，除去残留在创面上的化学物质，并用冷水浸沐伤处,可减轻疼痛，最后需要消毒,保护创面不受感染。

5、二度烧伤:损伤表皮及真皮层，皮肤起水泡，疼痛,水肿明显。创面如污染严重,先用清水或生理盐水冲洗,再以1:1000新洁尔灭消毒，不要挑破水泡,用消毒纱布轻轻包扎好，请医生治疗。

6、三度烧伤:损伤皮肤全层，涉及皮下组织,肌肉，骨骼,创面呈灰白色或焦黄色,无水泡,不痛，感觉消失。在送医院前,重要防止感染和休克，可用消毒纱布轻轻包扎好，给伤者保暖和供氧,必要时注射吗啡止痛。７、炸伤:

其急救措施基本同烧伤解决。但炸伤后伤口往往大量出血,应立即将伤口上部扎紧,防止流血过多。如发生昏迷、休克等,应进行人工呼吸,给氧，并送医院治疗。8、电击伤：急救时一方面使触电者脱离电源，为此可拉下电闸或用木棍将触电者从电源上拨开。当心别把触电者摔伤。断开电源后，检查伤员呼吸和心跳情况,若呼吸停止，立即进行人工呼吸。对心跳亦停止者要同时进行心脏挤压。电击伤比较轻微者，不久能恢复健康，重者必需请医生治疗。应当注意,触电者在进行急救时，一般不要注射强心针和喝兴奋剂。ﻬ实验操作须知１、实验室设计与规定实验室设计是由工作的目的和规模决定的，要合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一条连续的生产线,避免有的环节倒排增长日后工作的承担或引起混乱。房屋可规划为洗涤室、灭菌室、配制室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移栽室等。1.1准备室需备有的设备有:鼓风干燥箱、落水架、工作台、水池、水桶、水盆、试管刷等,重要用于玻璃器皿、用品和培养材料清洗；还需要有高压水龙头用于冲洗。１.２灭菌室需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培养基及培养器械的灭菌。1.3配制室需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、物品存放架以及各种玻璃器皿和用品，涉及各种不同容积的容量瓶、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶、广口瓶、各种类型培养瓶、玻璃棒、移液管架、试管刷、电炉、微波炉等。1．4无菌操作室(接种室)无菌操作室在工作方便的前提下,宜小不宜大,宜精细密闭，忌粗陋放散,是植物组织培养研究或生产工作中最关键的部分,关系到培养物的污染率,接种工作效率等重要指标。规定如下:（1)地面、天花板及四壁尽也许光洁、避免积染灰尘，易于采用各种清洁措施。（2)干爽、安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫外灯１-2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。(3)最佳安顿一小型空调机，使室内温度保持在26℃左右,这样就可以在工作时或不工作时都把工作室的门窗紧闭,保持与外界相对隔绝的状态,尽量减少与外界的空气对流,减少尘埃与微生物侵入。（4)经常采用消毒措施，达成较高的无菌水平,以利完全操作提高工作的质量与效率。(5)无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋洗手及解决外界采回准备消毒培养的材料等。无菌操作室应备有超净工作台或接种箱、固定式载物台、移动式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。１.5培养室应尽量安排在楼层较高处，以利于采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁、干燥,培养室保温隔热。培养室中距离窗户较远处的培养架应适当安装人工辅助照明的日光灯。应设计能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风散热,如在室内地板稍高处设立进风气窗，在气窗的对侧近天花板设立排风窗，也可安装小功率的排风扇。室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固定式培养架、旋转式培养架、摇床等。1．6鉴定室需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、烤片台、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。1．７驯化移植室应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等，用于试管小植株的锻炼和移植。2、操作前的准备工作接种室在接种前4-5d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒,一般用40%福尔马林进行全面喷雾,并密闭２4ｈ,然后打开换气窗10-15min.。接种前1h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射3０mｉｎ。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯,再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后体息时，要先打开台面的紫外灯,再关风机,最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。不可穿工作服离开接种室,接种期间两边的门牢记要关闭。3、准备进台进入接种室前，应先将手表、手镯、戒子、耳环等放在室外，将手和手腕用肥皂洗净后才干进入接种室,并用75%酒精纱布擦拭双手、双腕(此纱布置于超净工作台外烧杯内,并适时注入酒精）之后换上消毒的工作服、帽子、口罩(盖上鼻子和嘴、着装时注意头发不得置于帽子外，袖口用皮筋扎紧),进入台内。操作前用台内的酒精棉团擦拭手、手腕，再擦培养基和超净工作台，一般按如下顺序擦拭培养瓶：瓶的棉塞、瓶身、瓶底,彻底擦拭后放入超净工作台。4、接种操作4.1、剪、镊消毒每次取出时剪口并拢,不可接触磨口瓶和其它器皿,并保持尖端向下;剪、镊分别在酒精灯外焰彻底灼烧,烧时将剪口镊口张开,烧至剪、镊上部,火焰熄灭后，插回磨口瓶。4.2、用上述消毒过的器械,将切割好的外植体插植到培养基表面上，具体操作是：(1)左手拿三角瓶，解开包头纸,将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,使瓶口的水气散发掉。（2）右手小指和无名指配合手掌将棉塞在灯焰附近慢慢拔出，以免空气速向瓶内冲击,引起瓶口灰尘等冲入,导致污染。（3)棉塞始终夹在右手两手指之间，这时再将瓶口在灯焰上旋转，使充足灼烧灭菌。(4)用右手大、食、中指拿镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基中,镊子灼烧后放回磨口瓶，再把棉塞在灯焰上灼燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏,塞好棉塞，包上报纸,便完毕了第一瓶的操作,接着再做第二瓶，如此直到外植体所有接完。操作中必须遵守的事项：(1）棉塞不能乱放。手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分,塞入瓶口的那一段始终悬空，并不要碰到其它任何物体；若是螺旋盖或薄膜，则应解下放置在灭过菌的台面上,放置处应随时用酒精棉团涂抹灭菌。(2)操作人员的头、胳膊等不得进入台内。（3)操作人员不得随意谈话、说笑,以免导致污染。(4）台外人员走动要轻、动作要小。（５）接种完毕后注意标明接种材料名称、日期、解决。5、培养器材的清洗在细胞工程实验中,离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质涉及解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01μg／Ｌ就会对细胞产生毒性作用,因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。5.1、玻璃器皿浸泡初次使用和培养后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常带有许多干涸在上面的灰尘，同时又由于生产的因素，常呈碱性并带有一些对细胞有毒性的物质,如铅和砷等。在使用前要经稀盐酸（５%)浸泡,中和其中的碱性物质便于清洗。用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着,干涸后不易刷洗掉,故用后要立即用清水浸泡。刷洗浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗去玻璃器皿上的杂质。刷洗次数太多,会损害器皿的表面光洁度,洗涤剂有使pＨ上升的趋势，所以宜选用软毛刷和优质的洗涤剂。禁用去污粉,因其具有沙粒,会严重破坏玻璃器皿的光洁。酸洗刷洗不掉的极微量杂质通过洗液的强氧化作用可被除掉。洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效,是清洗过程中最关键的一环。洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成,浸泡时,器皿要充满洗液。常用的洗液配方见附表一。冲洗刷洗和洗液浸泡后都必须用水充足冲洗，不留任何残迹，然后用蒸馏水漂洗2~3次，凉干备用。5.２塑料器皿塑料器皿耐腐蚀能力强，但质地较软，且不耐热，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充足浸泡和冲洗;再用2％ＮａOＨ溶液浸泡过夜,自来水冲洗,然后用5％稀盐酸浸泡３0分钟，再用自来水冲洗,最后用蒸馏水漂洗３次,晾干备用。5.3滤器玻璃滤器与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是酸浸，都可用抽滤法。１）

使用后,立即将清水注入滤器,抽气过滤,反复抽滤5次。2）

干净铬硫酸洗液或热浓硫酸注入滤器,抽气过滤至酸液滤过完毕。３）

用清水再次抽滤10次。4）

蒸馏水抽气过滤３次。蔡氏滤器使用后弃去石棉滤膜，金属部分刷洗干净，最后用蒸馏水漂洗2~3次，晾干备用。新购置的胶塞带有大量滑石粉,先用自来水冲洗干净，常规解决，每次用后的胶塞用水浸泡,然后用2％NaＯＨ煮沸1５min左右,自来水冲洗,再用1%稀盐酸浸泡３0miｎ，最后用自来水冲洗和蒸馏水漂洗,晾干后备用。

ﻬ实验一培养基母液的制备

一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。在配制培养基前,为了使用方便和用量准确,经常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时,只需要按预先计算好的量吸取母液即可。二、实验器材电光分析天平（感量为0.00０1g）、扭力天平（感量为0.01g)、台秤(感量0．5ｇ)、烧杯（５00ml、１0０ml、50mｌ)、容量瓶（１０0０mｌ、100ml、50ml、25ｍl)、细口瓶（10０0ml、10０ml、5０ml、２５ml)、药勺、玻璃棒、电炉。三、实验药品NH4ＮO3、

ＫＮO３

、CaCl2·2H2O

、

MｇＳO４·７Ｈ2Ｏ、KH2PO4

、

KＩ

、H3BO3

、ＭnＳO4·4Ｈ2O、ZｎＳＯ４·7H2O、Na２MｏO4·2H2O

、ＣuSＯ4·5H2O

、CoCｌ2·6Ｈ2O

、FeSO4·７H2O、Na2-EＤTＡ·２H2Ｏ

、肌醇、烟酸

、

盐酸吡哆醇(维生素B6)

、盐酸硫胺素(维生素B1)

、甘氨酸

。

四、实验环节1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，用感量为0.０1g的扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到100０ｍｌ的容量瓶中，即为1０倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时,每配１L培养基取此液100mｌ。表1MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度(ｍg／L）扩大10称量（mg)

1NH４NO3１65０165００

蒸馏水定容至1000ｍl2KＮO3１９00190003CaCl２·2H2O

4404400４MｇＳO4·7H2O37037005ＫH2PＯ41701700注意:(１)配制大量元素母液时，某些无机成分如Ｃａ2+、ＳO42一、Ｍg２十和H2PO4一等在一起也许发生化学反映,产生沉淀物。为避免此现象发生,母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充足溶解后才干混合,混合时应注意先后顺序。特别应将Ca２+、SO42一、Ｍg2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CａCl2·2H2O要在最后单独加入,在溶解CａCl2·2H２O时,蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CＯ2，以防沉淀。此外,CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾,操作时要防止其溢出。２、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物(除Feﻩ)组成。微量元素用量较少，特别是

CuSO4·５Ｈ2Ｏ、

CｏCｌ2·6Ｈ2O

,因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2,表３配方，用感量为０.000１g的电光分析天平称量,其它同大量元素。配制培养基时,每配制1L培养基,取微量Ⅰ10ｍl，微量Ⅱ1ｍl

表２MＳ培养基微量Ⅰ的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大１0０倍称量（mg)1MnSO4·４H2O2２．3２2302ZnSＯ4·7Ｈ２O8.68603H3BＯ３6.２62０4KＩ０.8３８35Na2ＭoＯ4·2H２O02525

表3MS培养基微量Ⅱ的配制序号化合物名称培养基浓度(ｍｇ／L)扩大10０0倍称量（mg)１ＣuＳO４·5H2Ｏ

0．0２5252CoCl2·6H2O

0.０2525

注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,不易发生沉淀。配制方法同上,直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。

表４ＭS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大１0０倍称量（mg）１Na2-EDＴA

37．3373０２FｅSO4·7Ｈ2O

２7.82780

注意:在配制铁盐时，假如加热搅拌时间过短,会导致FｅS04和Nａ2EＤTＡ鳌合不彻底,此时若将其冷藏，FeS04会结晶析出。为避免此现象发生,配制铁盐母液时,ＦｅＳ０４和Na2EＤＴA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色（约加热20-３０mｉn）,调pH值至５．5，室温放置冷却后，再冷藏。4、有机母液的配制MＳ培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解,注意称量时用电子分析天平。注意:由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度减少，并且易给后期培养导致伤害,不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。表5MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度(mg／L)扩大倍数称量(mg)配制体积(L）１甘氨酸2500１0００.1２肌醇10020０２０2３0.１3盐酸硫胺素(VＢ1)0.４1000400.1４盐酸吡哆素(VB6）０.51000５00.15烟酸0.510０050０．1

５、激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.５mg／ml为好,需要注意的是:(1)配制生长素类，例如ＩAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充足溶解,或者用1mｏl/L的ＮaOＨ溶解,然后用蒸馏水定容到一定的浓度。(2）细胞分裂素,例如KT,应先用少量9５％乙醇或无水乙醇加3~４滴1mol／L的盐酸溶解,再用蒸馏水定容。(３)配制生物素，用稀氨水溶解,然后定容。注意:所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中,若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。五、思考题：1、

配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解ＣaCl2·２H2O时,为什么要将蒸馏水加热?２、

根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pＨ值,按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。培养基配方:MS+KT1.0+BＡ2.0+ＮAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.７%，pH5.８。

表6按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表

药品名称母液浓度1L培养基母液吸取量０.3L培养基母液吸取量大量元素１0倍液

微量元素Ⅰ100倍液

微量元素Ⅱ1０0０倍液

铁盐100倍液

VB10.４mg/mｌ

ＶB60．5mｇ/mｌ

烟酸0.5ｍg/ml

Gly1mg/ml

肌醇20mg/ml

BA０.5mg/mｌ

KT0.5mg/ml

NAA０.5mｇ/ｍｌ

蔗糖

琼脂

PH值5.8

实验二培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法。对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的规定不同，适当的设计和选用培养基,对植物组织培养取得成功至关重要的。此外,对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控,次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的重要成分涉及无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。二、实验器材天平、烧杯（1０00ｍl)、医用瓷缸(1000ｍl)、三角瓶、量筒（１０0ml)、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。三、实验药品蔗糖、琼脂、1moｌ/ＬＮaＯH、ＨCl、各种培养基母液。四、实验环节（一）

培养基配制（以１ＬMS培养基为例）1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式:吸取量ｍl=培养基中物质的含量（mg/L)×1000ｍl/母液浓度(mｇ/Ｌ）。2、移液取医用瓷缸一只,按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意：①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，假如发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗２次。③量取母液时，最佳将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉１种,以免犯错;④移液管不能混用。3、称取称取8g琼脂,３0ｇ蔗糖备用4、融化用搪瓷量杯量取600～７00ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂,边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下,加入蔗糖。注意：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开,否则沸腾的琼脂外溢,就需要重新称量、制备。此外，假如没有搪瓷量杯,可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水,否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢,导致烫伤。5、混合将融化的琼脂和母液充足混合,用蒸馏水定容到10０0ml，来回混合几次。６、调pＨ用滴管吸取物质的量浓度为1ｍoｌ／L的ＮaOH或HＣl溶液,逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌,并随时用精密的pＨ试纸(5.４~7.０)测培养基的pH,一直到培养基的ｐH达成规定为止（在调制时要比目的pH值偏高0.2~0．5个单位，由于培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，ｐH值会下降0.2～0．5个单位左右)。注意：调至时要用玻璃棒不断的搅拌,使其充足混合。７、分装溶化的培养基应当趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50ml或１00ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基,可分装25~30瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子,用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。注意:培养基中的部提成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值减少，从而使琼脂凝固力下降,发生培养基灭菌前凝固,灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是：调整培养基pH值，一般不低于5.6,若需酸性较强培养基，可适当增长琼脂用量。(二)培养基的灭菌培养基中具有大量的有机物质,特别含糖量较高,是各种微生物滋生、繁殖的好场合。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间,假如培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此,培养基的灭菌,是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等,放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝,注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动,当指针移至０.5kg/ｃｍ2时,扭开放气阀排除冷空气,使压力表指针回复零位。当指针移至1．1~1.2kg/cm2时,即121℃时，维持一定的时间。由于容器的体积不同,瓶壁的厚度不同,所以灭菌的时间也要适当考虑,具体可以参考表１。灭菌后要趁热取出三角瓶，不可久不放汽,让压力锅自行冷却,这样易将棉塞等闷得太湿,引起后来长霉污染。培养基自然冷却凝固。放置1d后再使用。

表１培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间容器的体积（ｍl）在１21℃下最少灭菌时间（miｎ)20~50１575~1５0２02５0~５0０251０0030１50035202３40注意：（1）锅内冷空气必须排尽,否则压力表指针虽达成一定压力,但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达成一定压力后，注旨在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间,时间过长会使一些化学物质遭到破坏,影响培养基成分,时间短则达不到灭菌效果。对蒸馏水,各种器具灭菌时,灭菌时间要适当延长，压力也要提高,一般在126℃维持一个小时。此外三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100℃时，培养基会喷溢,导致培养瓶壁和封口膜的污染。(2)消毒后的培养基不能立即用于接种,而应放置24-72h。放置后假如培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。此外做好的培养基一般应在1－2周内用完,短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4℃条件下。

表２饱和蒸汽压力与其相应的温度饱和蒸汽压力ｋg/cm2磅/平方英寸温度℃饱和蒸汽压力kg／cm2磅/平方英寸温度℃0.０01００1．055151２1.00.14１2103．61.1251６１22.０0.2814１06.91.2６618124.１0.44261０9.８１．4０６20１26．00.５6３8112．61.54322127.80.70310115.21.68124１２9.60.8４４121１7.6

30134．50．９８4１４119.９

5０１47.６

2、过滤除菌培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中也许会降解。这类物质需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子,如赤霉素（GＡ)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌解决，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至4０℃，再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。假如是液体培养基，没有凝固这个问题,则可在冷却到室温后再加入。ﻫ

除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于0.4μm。过滤灭菌的原理,是溶液通过滤膜时,细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器,它由注射器、滤器(可更换)、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好，最佳放在有螺旋盖的玻璃罐中,经高压灭菌,滤器灭菌不应超过121℃。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，在液量多时多用几套这种装置(亦可适当反复使用)也能顺利完毕液体灭菌操作。在使用前按无菌操作规定将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口,推压注射器活塞杆,将溶液压过滤膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。在一般情况下，人工配制的溶液不会具有使植物致病的病毒。更严格的实验研究中，这一点仍不容忽视。毫无疑问,过滤过的溶液要按无菌操作规定尽快加入培养基中，以免重新遭到污染。假如需通过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除，这样可以减少细菌滤膜微孔被堵塞的情况。

实验三培养材料灭菌和接种一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验,领略无菌培养对实验材料消毒,接种的规定，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。三、实验药品及材料０.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根,绿豆种子、培养基母液。四、实验环节（1)准备好培养基,无菌水，培养皿及接种工具。（２）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关,同时打开接种室内的紫外灯,用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯,开送风开关,关闭台内的紫外灯,通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。（3)接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75％酒精的棉球把手消毒一次。(4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。（５）将种子放于200ml的广口瓶中，用７５%的酒精溶液浸泡30s,无菌水冲洗,然后用0．1%升汞溶液（加入吐温2滴）浸泡３、５、10ｍiｎ，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。（6)解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75％的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下,把三角瓶按培养基解决整齐排列在接种台左侧,然后用７5%酒精擦洗接种台表面。（7）接种用的镊子使用前插入９5%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧半晌，冷却后待用。也可以插入培养基边沿促使其冷却。(8)在酒精灯火焰旁揭去封口膜,将瓶口倾斜接近水平方向,用火焰灼烧瓶口,灼烧时应不断转动瓶口(靠手腕的动作,使试管口沾染的少量菌得以烧死)，左手持瓶,使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分,使其冷却,夹取绿豆种子，将其放在培养基上,用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放４-6个外植体。（9）转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下,盖上封口膜,扎好绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。(１0）将接种材料移到培养室培养。注意:（１)从室外取得材料,要用自来水冲洗数分钟,对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料,冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。(2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素,最佳选用两种消毒剂交替浸泡,初次实验灭菌时间要设立一定的时间梯度来拟定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作(比如说、笑、打喷嚏)，以免影响气流,导致污染。此外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。（４)接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面，且重要是真菌时，也许是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净,菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则也许是由使用污染的贮藏母液引起。此外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的因素。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序,保证灭菌时间。（５)接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀，此种情况重要是接种过程中发生的污染所致。也许是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等因素引起。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌;在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于２0-30min;用75%酒精喷雾杀菌降尘,超净台启动1５-20mｉn后方可使用;镊子等接种工具严格彻底灭菌,且接种时使用1次灭菌1次;操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。（6）接种后外植体周边发生菌类污染也许因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15ｍiｎ，自来水冲洗０.5-2ｈ后，再选择适宜的灭菌剂消毒,一般用０.1-０.２%升汞灭菌最佳。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增长其渗透性，以提高杀菌效果。

表1植物组织培养中常用的消毒剂消毒剂名称使用浓度(%)消毒难易灭菌时间（ｍｉｎ)消毒效果乙醇70~75易0．1~3好氯化汞0.1～０.２较难2～15最佳漂白粉饱和溶液易5~30很好次氯酸钙9～１0易5～30很好次氯酸钠2易5~3０很好过氧化氢10~１2最易5~15好

五、思考题１、接种后污染调查观测接种后2~5天的污染情况，填入下表:

观测日期接种日期接种数污染数污染率重要污染菌种

注：污染率（%）＝（污染的外植体数/总接种外植体数)×1０0%假如培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短;若接种材料虽然没有污染,但材料已发黄，组织变软，表白消毒时间过长，组织被破坏死亡;接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。２、外植体用消毒剂消毒后,为什么要用无菌水漂洗?有时候会在消毒溶液中加入1~2滴的表面活性物质，例如吐温８０或吐温2０，为什么?３．在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染?4.对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？

实验四愈伤组织的诱导与增殖一、实验目的与意义学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素,对有些植物材料而言,生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿三、实验药品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根、培养基母液、2，4－Ｄ、水解酪蛋白(CH）。四、实验环节１、培养基配置诱导胡萝卜愈伤组织的培养基为：MS+2,4－Ｄ1．５ｍg/L+ＣH500mｇ／Ｌ+3%蔗糖＋0．7%琼脂,pH5.8。愈伤组织增殖培养基:ＭＳ+２，4-D0.５ｍｇ/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0．7%琼脂,pH5．8。2、胡萝卜营养根的消毒。a．将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织。将胡萝卜切段,每段厚约0.5ｃm。ｂ.把胡萝卜段用无菌水漂洗干净。c.用75%的酒精溶液浸泡3０ｓ。ｄ.用0.1%氯化汞浸泡2、5.10.12min,在浸泡过程中用镊子搅拌，以使消毒充足。e．浸泡过的胡萝卜段用无菌水冲洗３-５次,洗去残留的氯化汞后切片。３、解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基解决整齐排列在接种台左侧,然后用７５％酒精擦洗接种台表面。4、胡萝卜营养根切片胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。在切片消毒之前一方面除去皮层的最外层,以减少胡萝卜营养根的带菌量。形成层的分生能力最强，是产生愈伤组织的重要部分，因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。具体操作方法和环节如下:胡萝卜的截面图沿图中竖线切开沿图中竖线切成一方面沿横线把胡萝卜段切开两边部分弃去(如图)切片,每片厚0.５-1ｍm图—1胡萝卜营养根切片的制作注意:消毒以后的所有操作过程,都应在超净工作台上进行,操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯火焰上炽烧半晌,冷却后再切割。5、轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌,同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却,以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝,用镊子取出切好的胡萝卜切片放到培养基表面，用镊子轻轻向下按一下,使切片部分进入培养基。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用封口膜封口,同时在牛皮纸上写上培养材料、接种日期、姓名等。注意:植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素，研究具体问题要设立一定的浓度梯度,以寻找最佳浓度。五.思考题1、观测接种的外植体在接种１周后产生愈伤组织的颜色和质地,计算愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率（％）＝（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数)×1００%２、分析影响愈伤组织诱导和分化的重要因素。

ﻬ实验五愈伤组织的分化一、实验目的与意义了解愈伤组织再分化原理,学习诱导愈伤组织分化的方法。愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种限度上得到表达，随着着反复的细胞分裂,又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化。在一定的培养条件下，愈伤组织通过度化可以形成苗或根的分生组织甚至是胚状体，继而发育成完整的植株。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球。三、实验药品及材料培养基母液、6-BA、NAＡ、IBA、蔗糖、琼脂。四、实验环节（1）诱导胡萝卜愈伤组织(参见实验四）。(2)配制生芽和生根培养基。分化培养基（生芽）:MＳ+6-BA１mg/Ｌ+ＮＡA０.1mg/L+蔗糖3％+琼脂０.7%,pH5.8生根培养基:1/2大量元素+MS其它成分+IBA1mg／L+蔗糖3%+琼脂0.7％,pH5.8(3)按照无菌操作,小心挑取愈伤组织3～5，放置到分化培养基中。注意标明接种日期和外植体名称。(4)放置培养室培养,10天后记录愈伤组织分化情况。五、思考题1．记录愈伤组织分化率,生根率。分化率（％)＝(生芽愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数）×1０0%生根率（%)=（生根愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数）×１00％２.愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关?

实验六植物细胞悬浮培养与同步化一、

实验目的与意义学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法。植物离体细胞作为生物反映器具有生产周期短、提取简朴、易规模化、不受外界环境干扰，并且产量高、化学稳定性和化学特性好等特点，运用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者们的重视，也有成功的先例。同时,研究发现,离体培养条件下，细胞系的种类以及培养条件、培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度对目的产物的产量有很大的影响。二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、手动吸管泵、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机。三、实验药品培养基母液、2，4－D、蔗糖、琼脂。四、实验环节1、

诱导愈伤组织形成（参见实验四)。2、

制备液体培养基:MS＋2，4－D1mg/L＋蔗糖3%３、

在超净工作台上,从形成愈伤组织的培养瓶中,挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织、放入盛有30mｌ液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻捏碎愈伤组织。每瓶接入约2g重的愈伤组织,置于震荡摇床固定,在黑暗条件下或弱散射光下100r/mｉn震荡培养。4、

将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中（孔径47μｍ，81μm或更大）。5、

假如网眼被细胞团堵塞，可用吸管反复吸、吹。６、

再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。7、

反复环节４～6。8、

将通过较大孔径的细胞悬浮液，再通过较细孔径的尼龙网过滤(如3１μm,26μｍ)，用吸管反复吸、吹。9、

通过度级过滤的“同步化”细胞离心(50g,５分钟),收集后加入液体培养基进行培养或进一步同步化。五、思考题1、

研究细胞悬浮培养的意义何在?挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题?2、

建立细胞悬浮系的环节涉及哪些？一个良好的悬浮细胞培养体系应当具有什么样的特性？

ﻬ实验七细胞微室培养一、实验目的与意义了解和掌握细胞微室培养的方法。微室培养是为了进行单细胞活体连续观测而建立的一种微量细胞培养技术。运用这种技术可以对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程、胞质环流的规律,以及线粒体的生长与分裂进行活体连续观测;也可以对原生质体融合、壁的再生，以及融合后的分裂进行活体连续观测,因此它是进行细胞工程研究的有用技术。二、实验器材超净工作台、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液管、吸耳球、毛细管、常规接种工具。三、实验药品培养基母液、2，４-Ｄ、水解酪蛋白(CH）、蔗糖、琼脂、HCl、NaOＨ、四环素眼膏。四、实验环节1、愈伤组织的诱导（参照实验四）。２、单细胞悬浮液的置备（参见实验六)。3、

将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上灭菌。４、

冷却后按盖玻片的大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏。5、

将制得的细胞悬浮液一小滴滴在载玻片上，在四环素眼膏上放一小段毛细管，盖上盖玻片。6、

轻压到密封并使细胞悬浮液的小滴与盖玻片接触。7、

将载玻片放入培养室中，在温度为26－28℃条件下进行培养。８、

运用相差显微镜进行观测。五、思考题微室培养中应注意哪些问题？(从对微室的规定、培养基的规定、所观测的细胞的规定三方面考虑)。

ﻬ实验八原生质体培养一、实验目的与意义学习原生质体制备和培养的方法。原生质体分离纯化后,在适当的培养基上应用合适的培养方法,可以再生细胞壁,并启动细胞连续分裂,直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。以黄化绿豆下胚轴弯沟分离原生质体，该部位细胞具有较强的分裂能力，分化的限度不高,分离的原生质体经培养后很容易分裂。二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器三、实验药品ＭS培养基各种母液、NＡA、６-BA、2，4-D、2-N-吗啉乙磺酸(MES）、纤维素酶(OｎozukaR-１0，Jａpaｎ)、崩溃酶（Ｄｒｉselase)、果胶酶（Ｐｅcｔinase、Ｓerｖa)、半纤维素酶(Hemicellulaｓe，Sigｍａ)、离析酶(MacerozymeR－１０）、CａCl2．２Ｈ2O、ＫH2PＯ4.Ｈ２O、ＫN0３、MgＳ04．7H2０KI、CUS０4.5H２O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂。四、实验环节１、培养基及试剂的配制绿豆原生质体培养基:MＳ+2,４-D0.２+NAA1+BA0．5+蔗糖2５0mｇ／L+葡萄糖１0000ｍg/L+(琼脂１.2%)ＣPW溶液:KH2P0４27．2mg/Ｌ,ＫN0３１01mｇ/Ｌ,CaCl2．2H2014８0mg／L,MgS0４.7H20２4０ｍｇ/L,KI0．16ｍg／Ｌ,CｕS04.5H2００.０２5mg/L，ｐH５.6)。绿豆质壁分离液ＣPW－1３M的配制：具有13%甘露醇的CPW溶液绿豆细胞壁酶解液:2%（W/V）纤维素酶(celluｌaseＯｎzukaR－1０)、1%（Ｗ/V)半纤维素酶（hｅmicellｕlaｓeＨ-２12５,0.026uｎit/mg)、0.5%(W／V）果胶酶（pectｉnase,0.15unit/mg)、0.5％离析酶（MacerｏzyｍeR-１0)的CPW-9M(具有９%甘露醇，5ｍmｏl/LMES的CPＷ溶液,ｐH５.2)液。洗涤液:含或不含２50μｍol/LCaCl2,含５mｍol/LMES的９%甘露醇溶液，ｐH6．0。2、无菌黄化下胚轴的获得经挑选的绿豆种子用70％乙醇表面消毒１min,0.１％升汞消毒８mｉn,无菌水冲洗3遍。播于培养瓶中,培养瓶中放入无菌滤纸，加入适量无菌水,以保持合适水分，27士1℃黑暗培养64ｈ。３、酶解选取下胚轴长3.5－4cm的黄化绿豆幼苗，从弯钩下3ｍｍ处，向下切取0.5mｍ的切片10个。置于CPＷ-13M溶液中,静置1h，使之质壁分离,而后移入酶解液中，在往复式摇床(3５-４0r/miｎ,25士1℃)上暗中酶解５-6ｈ。材料和酶解液的体积大约1:10。4、纯化用双层尼龙滤网(孔径6４um)过滤酶解液,滤液10０×g离心10mｉn，弃去上清液。用少量CPW－9Ｍ溶解沉淀,小心加入盛有CＰW－21S（具有２1%蔗糖的CＰＷ溶液,pH5-6)溶液的离心管中，1００×ｇ离心5min，溶液分为3层，仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出，经洗涤液洗涤2次，离心，获得纯净的、具有生理活性的原生质体。5、密度测定与调整将原生质体溶解在培养液中,用血细胞计数板记数。６、培养用融化的培养基将原生质体密度调整为5×105/mＬ，将其植板于培养皿中,使成一薄层,凝固后，切成4个扇形快,加入液体培养基，使扇形块漂浮其中,置于27士1℃黑暗培养,培养７、14、2１d，除去旧液，加入新培养基（蔗糖含量为2０mg/Ｌ，葡萄糖１0g/L,其他成分与MS相同。培养一周后能见到几个细胞以上的细胞团。继续培养细胞团形成愈伤组织。五、思考题原生质体制备与培养过程中要注意哪些问题？常用的原生质体培养方法有哪些？

实验九烟草原生质体融合一、实验目的与意义学习和掌握运用化学诱导剂诱发原生质体融合的方法。种间有性杂交不亲和大大限制了野生种有用基因向栽培作物的转移。通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建，是克服这种生殖隔离的一种重要途径。现有的融合技术中,以聚乙二醇(PEG)诱导融合和电融合两者占重要地位，其中PEＧ融合技术具有设备简朴、操作方便等优点，至今仍然广泛采用。但现行ＰEG融合技术是在原生质体群体的条件下进行的,因而在融合产物中除了所欲获得的杂种细胞外，还不可避免地具有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质体的融合体，从而增长了融合后筛选的困难。此外，在有些情况下，可供融合的亲本原生质体数量很少，因此在方法选用上要充足考虑这些因素。二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器、Parafilm封口膜。三、实验药品MS培养基各种母液、KT、NAA、２,4-Ｄ、MES（2-Ｎ-吗啉乙磺酸)、纤维素酶(OｎozukaＲ-１0,Ｊaｐaｎ)、崩溃酶(Ｄｒｉｓeｌasｅ)、果胶酶（Peｃtiｎase、Serva）、半纤维素酶(Ｈｅｍiｃeｌlulａsｅ,Sｉgma）、离析酶(MaｃerozymeR－10）、CaＣl2．２H2O、ＫH2PO４．H2O、KN03、MgS0４.７Ｈ20KI、ＣuS0４.5Ｈ2Ｏ、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂、聚乙二醇、二甲基亚砜。四、实验环节1、实验材料实验材料为普通烟草品种“自来红”和波缘烟草。种子在７０％酒精中浸泡３0s,无菌水冲洗一次后,用０．1％升汞消毒8min,无菌水冲洗六遍，培养于MS基本培养基上。于25℃下诱发无菌苗。将丛生芽在相同培养基上每4-5周转接一次。取普通烟草完全伸展叶片(约3×５cm)作为分离原生质体的材料。对于波缘烟草，以叶片外植体在MS培养基(附加2，4－Dｌmｇ/L，NＡA２mｇ/L,KＴ0.5mg/L）诱导的愈伤组织为分离原生质体的材料。2、原生质体的分离撕去下表皮，在无菌培养皿中将普通烟草叶片切成约０.５×0.5cm小块，和波缘烟草愈伤组织各约1g鲜重分别置于l0ml酶液（2%纤维素酶celｌulasｅＯｎzukａＲ-１0、１%半纤维素酶hemiｃelluｌａｓeＨ－21２5,、0.5%果胶酶ｐecｔinase、0.５%离析酶MaｃerozymeＲ-10的CPW-９M液）中。在2８℃下解决3-4h。叶片材料不时轻轻摇动，愈伤组织则在摇床上振摇(３0rpm)。酶解产物经400目尼龙网过滤后，100g离心３miｎ收集原生质体。然后用洗液(CPＷ盐+９%甘露醇)洗３次(１０0ｇ,离心1mｉn)。小心加入盛有CPＷ－２１Ｓ(具有2１%蔗糖的ＣPＷ溶液，pＨ５-6)溶液的离心管中，100g离心５min，溶液分为3层，仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出，经洗涤液洗涤2次，离心，获得纯净的、具有生理活性的原生质体。用洗涤液将原生质体密度调整到1~５×105个细胞/mｌ，待用。3、原生质体融合原生质体融合采用PEG和高Ｃａ２+、高pH法。将双亲原生质体等量混合后，室温将2滴原生质体悬液滴在置于直径5ｃm培养皿中的2５×25mm盖玻片上。静置２0ｍin后从液滴边沿加人1滴溶液A(含分子量6000的PEG4０%,葡萄糖0.3mｏ1／L,CaCｌ2６6mmo1/L,二甲基亚砜１0％)。再静置20min后,将溶液尽也许吸出并加入尽也许多（但不使溶液流下盖玻片)的KM培养基。10ｍｉn后换以适量新鲜培养基。培养皿用Pａrａfiｌm封口后置于2５℃散射光条件下培养。10天后将原培养基吸掉一半,换以等量的渗透压减半的新鲜培养基。４、芽分化待形成肉眼可见愈伤组织时将其逐个挑出建立源自单个细胞的克隆系。芽分化培养基为ＭＳ培养基附加BA2mｇ/L,ＩAA0．5mｇ/L,CH20０mｇ/L,甘露醇20ｇ/Ｌ，蔗糖3０ｇ/L，琼脂8g/Ｌ,pH5．8。5、生根芽长至3-5ｃm时转至ＭS基本培养基上诱导生根。五、思考题查阅相关文献，设计一组实验方案来鉴定所得的愈伤或植株是真正的融合体。ﻬ实验十烟草叶片组织培养一、实验目的与意义掌握运用叶片作为外植体进行无性繁殖的方法。烟草是重要的经济作物和工业原料作物,其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料，最近证实可运用烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质。有关烟草的组织培养体系的建立报道很多，运用本实验建立的烟草组培快繁体系，可认为运用农杆菌的遗传转化来改良烟草品种和运用烟草细胞培养物进行烟碱等次生物质的生产奠定基础。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀。三、实验药品MS培养基各种母液、2，４-Ｄ、KT、6－BA、NAＡ、ＩＡA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞。四、实验环节1、培养基的配制①愈伤组织诱导培养基:ＭS+2,4-D1.0mｇ/L(单位下同)＋NAA2.０＋KT０.5。②愈伤组织分化培养基：MＳ＋KT２．0+IＡA０.5。③幼芽增殖培养基:MＳ＋6-BＡ1.0+ＮAA0．2。④生根培养基：MＳ+NAＡ0.２。上述培养基均附加3％蔗糖，0.8%琼脂,pH5.8。２、接种取烟草幼嫩叶片用自来水充足洗净后，经7５%酒精消毒３0s,0.1%升汞溶液浸泡８mｉn，无菌水冲洗5-6次后，去掉主叶脉和大的侧叶脉，将叶片切成1.0-1.５cｍ2的小方块,接入①中培养,接种时下表皮与培养基接触。培养温度25士2℃，光照１４h/d，光照强度2０23ｌx。每三角瓶接种3-５个外植体。３、愈伤诱导约2-3ｄ后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀,１5d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织。４、愈伤组织的分化将愈伤组织转接到分化培养基②上，15d后,从疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。4０ｄ后，从愈伤组织上分化出越来越多幼芽。５、幼芽的增殖将幼芽切下,转接至不加２,4-D的幼芽增殖培养基③上,可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。６、诱导生根及移栽取约3-4ｃm长的无根小苗接种于生根培养基④中，约7－8d后，外植体从其基部产生白色幼根，当试管苗长至5-６cm高时,打开瓶口,在散射光下放置２d后取出，洗去根部残留培养基，种植于通过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中,成活率可达95%以上。五、思考题以烟草为材料,查阅相关文献，设计烟草遗传转化实验（运用农杆菌介导法)。

实验十一月季组织培养一、实验目的与意义掌握运用茎段作为外植体进行无性繁殖的方法月季属蔷薇科，在欣赏植物中占有重要地位。根据其栽培技术的规定,以往的传统方法，多采用野蔷薇种子播种,在2-3年生的实生苗上嫁接,此法不仅繁殖系数小，且成本较高,生长缓慢,而组织培养技术的应用，使得月季育苗发展迅速。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀。三、实验药品MＳ培养基各种母液，6-BA、NAＡ、IＡＡ、蔗糖、琼脂、酒精、升汞。四、实验环节1、培养基的配制增殖培养基：ＭS+６-BA１．5+NAA0．１+蔗糖3%+琼脂0.7%生根培养基:１/2MS+IBA０．5＋蔗糖３%＋琼脂0.6%２、外植体的获得选用嫩茎为材料，取带芽的茎段,一般以顶端以下第３-1０节上的芽为好,采回枝条剪去叶柄,再剥去附在茎上的皮刺，先用自来水冲洗枝条表面的尘土,然后把枝条段截成2-３cm小段，每段带１-2个侧芽，用70%酒精灭菌20s,再用０．1％氯化汞溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗4－５次。3、接种将灭好菌的材料在无菌培养皿中切成０.5cｍ的小段，接种到灭好菌的培养基上。4、培养培养温度２4℃－２6℃，光照时间８-10h,光照强度1２０２3x。5、分芽继代将丛生芽分割继代。6、生根培养选取苗长2cm以上的壮苗作为生根材料，接种到生根培养基上，一般在接种后一周开始观测，约1０d后发现有少量苗生根，20d后即可移栽。7、移栽．将培养有试管苗的三角烧瓶打开，在温室中炼苗2d,然后取出洗去根部琼脂,移至盛有珍珠岩与细沙(1:1)的花钵中，天天浇营养液，移栽成活率可达80%以上。五、思考题查阅相关文献,设计筛选月季芽增殖体系建立的最佳激素组合。

ﻬ实验十二菊花组织培养与快速繁殖一、实验目的与意义掌握运用茎尖作为外植体进行无性繁殖的方法。菊花是数年生宿根花卉，原产我国，是世界上栽培面积较大的花卉,其品种多达约2500０种，我国的菊花品种也有7000种以上，是人们非常喜欢的一种常见花卉。在栽培过程中,菊花的繁殖多采用扦插法，但该法会导致优良品种的品质退化,究其因素,在于繁殖及栽种过程中感染了病毒，且病情随种植时间的延长而恶化，解决此问题的最佳途径是茎尖培养。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、解剖针、解剖镜。三、实验药品MＳ培养基各种母液,6-BA、NAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞。四、实验环节1、培养基的配制培养基是以MS为基本培养基，附加不同激素构成的．其中，①诱导侧芽生长培养基为：ＭS＋NAＡ0.1mg/L+6-ＢA５．0ｍｇ／L+蔗糖３%＋琼脂0.7％。②增殖培养基为ＭＳ+ＮＡA0.1mg／L＋6-BＡ3.0mｇ/Ｌ+蔗糖3%+琼脂0.７%。③生根培养基1/2ＭS+NＡＡ０.1mg/L+蔗糖３%＋琼脂0.７%。2、外植体的获得取菊花带顶芽茎段，长约２ｃm,于流水中冲洗去掉表面泥土,在超净工作台内将材料浸入７5%酒精３０-４5s,然后用0.1％HｇCl2消毒７-１0min，无菌水浸洗4~5次,材料放入无菌的铺有滤纸的培养皿内。3、诱导侧芽生长在解剖镜下,用接种针将菊花顶芽外面的幼叶小心依次剥掉，直至在解剖镜下能看清表面光滑、呈圆锥形的茎尖为止，再用已灭菌的解剖刀割取茎尖组织,长约０．5-0.6mｍ,接种于培养基①上。4、培养置于暗处1-2ｄ,然后转移至培养架上,通过ｌ0d菊花茎尖颜色逐渐变绿,基部逐渐增大,茎尖也逐渐伸长,一般２5d后,长出丛生芽。５、继代培养将丛生芽切割下，分开接种于培养基②之上,一般１５d后可长出丛生芽，取丛生芽转接于新的培养基②上,则可在更短的时间内（约10d)长出丛生芽,继代培养的次数越多，从接种到长出丛生芽所需的时间越短，但不短于7d，若不及时转接,芽苗会迅速长高。6、诱导生根取长约2-3ｃｍ的芽苗分开接种于培养基③上,进行诱导生根培养,ｌ0d左右就可出现大量小根，最后有1-6条根可长得较长,芽苗也迅速长高。7、试管苗的移栽在芽苗生根后,先将瓶塞打开，让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境之中约3d,将苗取出，小心用流水洗去根表面的培养基残留物,移栽到沙土中，适当遮荫，一星期后即可成活，成活率达95％以上,一个月后即可上盆。五、思考题查阅相关文献，以马铃薯为材料设计马铃薯脱毒苗实验方案,涉及脱毒苗的检测。

实验十三马铃薯茎尖脱毒一、实验目的与意义。掌握运用茎尖进行脱毒培养的方法。马铃薯是人们平常生活中的一种重要食物。由于长期无性繁殖,马铃薯病毒病较重,所以导致品种退化,产量和品质的大幅度下降。通过热解决,在无菌条件下剥取小于0.3mｍ的茎尖生长点进行组织培养成苗后,基本可以达成脱去病毒的作用，从而恢复产量及品种特性。二、实验器材光照培养箱、超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、解剖针、解剖镜。三、实验药品MＳ各种母液、６-ＢA、NＡA、ＧA3、酒精、升汞、蔗糖。四、实验环节1、

将表面光滑的马铃薯切块,埋在湿润的沙土中在室温下催芽。２、

待芽长至２cm时，将发芽块茎放入３7℃的光照培养箱，光照时间1２h/d，解决时间２8d左右。3、

剪取通过热解决的发芽块茎的茎尖1~2ｃm,自来水冲洗0.5ｈ,剥去外面的叶片。在超净工作台上进行严格的消毒。4、

用7５%的酒精浸15ｓ，无菌水冲洗２次,再用0．1%的升汞浸泡8~10min,无菌水冲洗3~5次，每次冲5mｉｎ,放在灭过菌的培养皿中待用。5、

在超净台上，把装有已消毒茎尖的培养皿放在解剖镜下，仔细剥离,直到出现圆滑生长点时,用灭过菌的解剖针切取0.1~0.5mm带1~2个叶原基的茎尖,接种于培养基上。培养基为：MS+GＡ30.1+ＮAＡ0．１+6-ＢA0.5+蔗糖3%＋琼脂０.6%。6、

将接种好的茎尖移到培养室中,于25℃、3000lｘ培养,大约5~７d茎尖转绿,40~50d成苗。7、

病毒检测。重要用ELISA或指示植物方法鉴定。8、

在无菌条件下，将试管苗切割成带一腋芽的茎段,接种在试管苗培养基：ＭS＋６-BA１.0+蔗糖3%+琼脂0．６%9、

当试管苗长高到3～４ｃm,具有5~7个浓绿色的小叶时进行移栽。在移栽前4～５d开盖炼苗，然后取出苗,洗净根部培养基,将其移入珍珠岩基质。移栽时用镊子将基质压割成1～２cm深的槽沟，覆上基质,用水浇湿，以便根部与土壤密接，易于成活。保持较高空气湿度，土壤不要过湿,光照应当充足,气温不宜超过30℃。１０、当植株高度达成1０～１5cm，具有5片左右完全展开浓绿的复叶时移入田间。五、思考常用的病毒植株的鉴定方法有哪些？

实验十四马铃薯试管微薯的诱导一、实验目的与意义。掌握运用马铃薯无菌苗进行微薯诱导的方法。茎尖脱毒与无性快繁技术应用于马铃薯种薯生产,能有效的克服病毒病对马铃薯的危害,并已产生了很大增产效果。离体条件下直接诱导试管微薯，实现工厂化生产脱毒原原种薯,可以加快脱毒马铃薯的繁殖,缩短种薯生产周期,从而大幅度提高马铃薯的产量。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、滤纸、牛皮纸、脱脂棉。三、实验药品MS各种母液、6-BA、水杨酸（SA)、酒精、升汞、蔗糖。四、实验环节１、

把通过检测不带病毒的小苗,切成带1~2个芽的茎段，转接于３0mｌ快繁培养基上,每瓶接15~20株,待小苗长至1０ｃｍ左右时,可以进行下次扩繁。快繁的液体培养基为:ＭS+6-ＢA１.0+蔗糖3％。固体支撑物为脱脂棉。2、

在20２３~3００0ｌx光下24h光照，25±１℃培养４0d左右。3、

于试管苗10~１5叶片，株高1０～1５ｃm时,在无菌条件下加入3０ｍl的诱导微薯的培养基。诱导微薯的培养基为：MS+6-BＡ5mg／L＋SＡ０．5mｍol／L+1２%蔗糖。4、

在黑暗条件下,15±3℃下,诱导试管微薯。5、

20d后,培养温度升高到25℃,天天光照２~３h,50d后采收微薯。五、思考SA和蔗糖在马铃薯试管微薯的诱导过程中起什么作用?影响微薯诱导的因素有哪些？

实验十五小麦幼胚培养一、实验目的与意义学习和掌握幼胚培养的一般方法。在远缘杂交中，杂种胚往往是败育的,这时候只有进行幼胚培养才干获得下一代的种苗，因此幼胚培养在远缘杂交中具有极大的运用价值。此外，幼胚在诱导基因转化受体、筛选突变体方面也具有重要的应用价值。因此幼胚培养越来越受到科学家们的关注。幼胚在胚珠中是异养的,需要从母体和胚乳中吸取各类营养物质与生物活性物质，因此进行幼胚培养时，必须通过培养基向它提供足够的营养,并提供适宜的培养条件。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀。三、实验药品MS培养基各种母液、NAＡ、６-BＡ、２，4－Ｄ、KT、蔗糖、琼脂。四、实验环节１、培养基的配制诱导培养基：ＭＳ+2，4-D2．0ｍg/Ｌ+KT0．5mg／Ｌ+蔗糖3％+琼脂0.6%。继代培养基：MＳ+2，4－D1.0ｍg/Ｌ+KT0．5mg/L+蔗糖３0g/Ｌ＋琼脂0.6％。分化培养基:MＳ＋IAA0．５mg/Ｌ+KT1．5mg/L+蔗糖３%＋琼脂0．6％。生根培养基：１／2MS＋NAA０.２+IAA０.５+蔗糖3%+琼脂0.6%。2、取材小麦出现第一朵小花起分别挂牌记录开花时间,15ｄ后从田间取回穗子,置于4℃冰箱内解决2４ｈ。3、接种剥出子粒，用75%的酒精消毒３0s,用0.1%升汞消毒8min，用无菌水洗三次,于无菌条件下将幼胚剥出接在诱导培养基上，盾片向上。4、培养接种后的培养瓶于2023～3０00lｘ光照，(25±1)℃条件下培养，25d记录出愈率,胚性愈伤诱导率。5、继代将胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养。6、分化将愈伤组织接种到分化培养基上。记录分化率:分化率＝产生绿色芽点愈伤数/接种愈伤数×１00%7、生根绿芽长到２～3cm时转到生根培养基。8、炼苗打开瓶口，在培养间炼苗2～3d,转到自然条件下炼苗2～３ｄ。9、移栽洗去小苗表面的培养基,移栽到小盆里,成活后移栽到大田。五、思考题植物胚胎培养分为哪些类型?各有何特点和规定?胚胎培养有何重要意义?

实验十六小麦成熟胚培养一、实验目的与意义学习掌握成熟胚培养方法。小麦的组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为小麦遗传转化操作的重要技术基础，一直受到广泛关注。前人已采