流式细胞术之基本原理及运用

主要内容一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的光信号检测流式分选二、流式细胞术在生物医学中的应用1.1流式细胞术简介流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；流式细胞仪的发展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式细胞分析-流动式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系统(解决难题)；1956Coulter原理(血细胞计数器)；1965Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；1969Vandilla等:第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大学:研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:单克隆抗体技术(促进流式发展)。流式细胞仪的分类分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。1.2流式细胞仪的结构组成液流系统流动室液流驱动系统光路系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器1.2.1液流系统鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图流式细胞仪液流系统示意图流动室流动室(flowcell,flowchamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器1.2.2光路系统（一）激发光源：激光器激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器（二）光束成行系统FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。11（三）光收集系统滤光片的组成长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/504605005404605005401.2.3电子系统光信号电信号数字信号（一）光电检测器(photodetector)光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光电二极管（二）电信号两种放大方式由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。

线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。通道(channel)

一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；荧光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。小结：

液流系统分析型流式结构光路系统

电子系统161.3流式细胞术光信号检测光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC);侧向散射光(sidescatter,SSC).荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。1.3.1散射光信号（一）前向散射光FSC

FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。（二）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。19（三）散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片（三）阈值Threshold阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后1.3.2荧光信号（一）荧光：

物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长(荧光波长)Emissionwavelength激发波长Excitationwavelength＜（二）常用荧光素<499nm蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。23（三）荧光抗体的选择A根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定)。如PARTECCyFlowSpace分析模块：多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

B根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。CD51.5流式分选

电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、培养板)lasers断裂点(充电)高压偏转板电荷式分选装置PARTEC

分选模块PPCSPiezoHV:400~560分选指标分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。分选时间表(机器流速10000个/s时)分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)纯化模式(purifymode)单细胞模式(singlecellmode)2流式细胞术在生物医学中的应用FCM可检测下列细胞成分：表面标记物胞浆标记物核内标记物可溶性成分