肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法

1第四章肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法2˙恶性肿瘤——常见病、多发病

˙全世界每年700万死亡；占欧美死亡第二位

˙我国城市居民第一位，农村第三位

˙恶性肿瘤人类健康重要——杀手进展较大,疑难问题很多。肿瘤动物模型和抗肿瘤研究方法具有重要意义。34肿瘤动物模型可分为三类：自发性肿瘤动物模型诱发性肿瘤动物模型移植性肿瘤动物模型5第一节

自发性肿瘤动物模型(animalmodelofspontaneoustumors)概念:未经人为处理；自然发生•

自发性乳腺癌模型•

自发性白血病模型6

一、自发性乳腺癌模型

生长在体表,易早期发现,罕有自发消退,因而能准确观察其大小与生长速度,便于进行实验。7

现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为

85%~100%。

A系小鼠：

经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30%~80%。

CBA小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为60%~65%。

8

在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每只小鼠常见1个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小相近的动物,配对分组,给予受试药,观察受试药对肿瘤发展的影响。

给药方案和给药途径可根据受试药物的特点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用间歇给药或小剂量连续给药较为合适。

9[结果判定]

给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时间和位置。

肿瘤结节长到一定程度,每周用脚规测量皮下肿瘤2次。测定肿块的最大径(a)和最小径(b)。

肿瘤体积(cm3)=ab2/210

将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线,可由曲线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用,尤其应观察肿瘤能否完全消退。11[注意事项]1.在同一品系内,发病率比较稳定,而不同品系间差别甚大。2.动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有关。

3.饲料的变更有明显影响,要用固定全价营养饲料。4.配对分组。12二、AKR白血病模型

AKR小鼠为白血病高发品系，淋巴细胞白血病发病率雄性76%~90%，雌性为68%~90%。[操作步骤]实验用6~12月龄AKR小鼠,此时鼠的脾和淋巴结肿大,血象异常。

经血液检查确诊为白血病后的次日,配对分组并开始给予受试药,观察结果。

13

观察指标：末梢血象,白细胞数,淋巴结和脾大小,动物生存时间。有效者生存期比对照组延长,并根据血象评价药物的诱导缓解和维持缓解作用。

各鼠白血病的病程不一,自发瘤确诊后,实验时应配对分组。

[结果判定][注意事项]14[自发性肿瘤的总体评价]

动物自发性肿瘤的病因往往是由动物的遗传特性决定的,与人癌的病因有较大距离。

各动物肿瘤生长速度差异较大,很难在限定时间内获得大量生长均匀的荷瘤动物(tumor-bearinganimals)

因此，自发性肿瘤动物模型很少在抗肿瘤药物的常规筛选中广泛应用。15第二节

诱发性肿瘤动物模型(animalmodelsofinducedtumor)概念:在实验条件下;

使用致癌物(carcinogens);诱发动物发生肿瘤16

[基本原理]

利用外源性致癌物引起细胞遗传特性改变，从而出现异常生长和高增殖活性细胞,形成肿瘤。

外源性致癌物主要有化学性、物理性(如放射性物质)及生物性(如诱发动物肿瘤的病毒),其中以化学性致癌物最为常用。17一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法

实验时,必需注意选择合适的致癌方法、动物种系、致癌物及其溶剂、给予剂量、途径以及观察时间等。致癌物的剂量应能保证动物的存活率较高、诱发期较短和诱发肿瘤频率较高。18常用的致癌物给予方法和途径1.涂抹法:

涂抹在背部及耳部皮肤,主要用于诱发皮肤肿瘤。2.经口给药法：通过饮水、饲料或灌喂动物。常用于食道癌、胃癌及大肠癌等。3.注射法：致癌物制成溶液,经皮下、肌内、静脉或体腔等途径注入体内,本法较常用。19常用的致癌物给予方法和途径4.气管注入法：常用于诱发肺癌。5.穿线法：将致癌物置于无菌试管内,加热使之液化,吸附于预制的线结上,再将此线结穿入靶组织而诱发肿瘤。6.埋藏法：包埋于皮下或其他组织内。20二、诱发性肿瘤模型的动物和致癌物动物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多环碳氢类亚硝胺类偶氮类黄曲霉毒素（饲料中含0.001~0.015ppm黄曲霉毒素B1,喂养6个月,诱发大鼠肝癌）。

ppm=partspermillion2122[诱发性肿瘤模型的总体评价]

约80%人癌是由环境因素引起的,诱发性肿瘤的病因与人癌的情况近似,且均经过较长演变过程而成瘤。动物诱发性肿瘤是比较类似于人类肿瘤的动物模型。

然而,人癌的发生原因十分复杂,往往并非由已知的动物致癌物所引起。另外,动物诱发性肿瘤的组织病理类型、发生发展过程也不一定与人癌完全一致。

23

本模型的最大困难是诱癌时间长、成癌率常达不到100%,而且动物之间肿瘤发生时间、发展速度的个体差异很大,难以将未治疗的动物作为治疗动物的对照。24第三节移植性肿瘤动物模型(Animalmodeloftransplantingtumors)25

移植性肿瘤动物模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或异种动物体内连续传代而形成的肿瘤。

该实验法是抗肿瘤药物筛选最常用的体内方法，具有重要作用。目前临床上常用的抗肿瘤药大多是首先经该实验法而被发现的。26

一般给予试验药7~10d,在第8~11d可解剖动物获得结果。通过一些指标的观察,可以判断试验药是否有具有抑制肿瘤生长的作用。这是任何体外试验所不能替代的,其结果可为抗癌药物疗效提供重要依据。27

它比前述的自发性和诱发性动物肿瘤更易实施。

现有移植性肿瘤接种成功率可达100%,可在同一时间内获得大量(数十至百余只动物)、生长相当均匀的肿瘤。28

移植性肿瘤常用的动物为小鼠、大鼠和地鼠。研究药物的抗肿瘤作用可选择三种或三种以上小鼠、大鼠的移植性肿瘤进行实验治疗；抗肿瘤药物筛选时，每批动物的来源应一致；一、动物的选择29

根据瘤株的特点选用近交系、远交系或F1动物；雌雄性动物均可应用(乳腺癌等必须用雌性动物)。

▲每批实验只用同一性别动物。

▲小鼠体重18~22g，大鼠体重50~70g

▲每组至少10只动物，裸鼠可用5~10只。30二、肿瘤细胞的选择

复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细胞株(瘤株，tumorstrain)或细胞系(cellline)。

细胞株(cellstrain)是指通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。31

瘤株的组织学类型和生长特征趋于稳定，并能在同系、同种或异种动物体内移植并连续传代。

生长特征，包括接种成活率、生长速度、自动消退率、宿主寿命与宿主反应等。

细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。

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目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、腹水瘤和白血病）约500种，还有大量人的瘤株或细胞系。常用的动物移植性肿瘤瘤株或细胞系有：

33肉瘤S180腹水型或实体型

艾氏腹水癌或实体型

肝癌腹水型（HepA）或实体型（H22）

小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16）

小鼠Lewis肺癌

肉瘤S37结肠癌C38、结肠癌C26

子宫颈癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）34

筛选抗癌药物时，最好选用3类瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，目前最受重视和应用最广的是：小鼠Lewis肺癌小鼠黑色素瘤B16小鼠白血病P388

瘤株或细胞系的选择应尽量考虑与临床拟研究肿瘤的性质、部位等相近，如拟研究肝癌的治疗，可首选肝癌瘤株。

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一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效，如果仅选一种瘤株进行药物筛选就可能出现漏筛。还必须指出，动物肿瘤的生物学特点与人类肿瘤有较大差别，对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人类肿瘤未必有效。36三、接种方法

(一)一般要求整个操作应在无菌条件下进行，可在无菌室和超净工作台内操作。动物处死后消毒皮肤，对每个实体瘤应分别使用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的注射器抽吸。

37接种方法

瘤块污染常是接种失败的主要原因，应特别注意!!在高温季节操作时，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块直接降温。

常用接种部位：实体瘤_____腋窝皮下肌肉接种___大腿肌肉腹水型肿瘤__腹腔

38(二)接种操作1.实体瘤

(1)基本过程（以实体瘤为例）冻存的瘤株--->移入宿主体内（瘤源动物）------->7-10d(增殖)获得瘤块--->制备瘤块--->给动物接种(受体动物)39

(2)瘤块接种法：选取接种后7~10d生长状态良好的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。切开皮肤，剥离出瘤块，置于平皿上,平皿应放置在冰块上,内置少许灭菌的PBS或其他营养液,剔除非肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、淡红色、鱼肉状的瘤组织，在无菌平皿内剪成2mm3的小块。

黑色素瘤则呈黑色或黑紫色

注意不用瘤中央的坏死部分40瘤源动物--->颈椎脱臼处死--->--->消毒切开皮肤--->取瘤剪成2mm3

小块--->用套管针抽吸瘤块接种于受体动物右前肢腋窝皮下缩短接种操作时间,从瘤块取材到接种完毕一般应在30min内；平皿内放置少许灭菌PBS或其他营养液；接种部位皮肤应先消毒。流程图：41

(3)瘤细胞悬液接种法

如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种:取几个瘤块--->除去坏死部分--->混合瘤块--->剪成小块--->匀浆器单向研匀--->放入无菌容器--->生理盐水稀释成1:3~1:4悬液

每只动物接种0.2ml；整个操作应在30min内完成；每次抽吸前应将细胞混匀。42

(4)培养细胞接种法：对数生长细胞→胰酶消化→PBS洗涤2次→计数活细胞数→用生理盐水稀释成细胞悬液→细胞悬液置于冰上→注射到接种部位(0.2ml,含1×106~1×107个细胞)。

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2.腹水型肿瘤

(1)抽取腹水：选择接种后7~10d的健康动物颈椎脱臼处死--->腹部皮肤消毒--->剪开剥去腹部皮肤--->抽吸腹水--->放入无菌容器内--->若用几只动物作为瘤源动物时,应将腹水混合.4445

另取小量腹水,置于加有肝素的干试管内,作为观察细胞形态及细胞计数用。

将空针中剩余的腹水制备推片,瑞氏染色,镜下进行细胞分类计数,其中瘤细胞数应≥95%。

抽出的腹水应为乳白色浓稠液体,若为黄色或含有大量红细胞时应弃去。46

(2)细胞计数：

取肝素管内的瘤细胞,用生理盐水稀释10倍;取稀释液0.9ml,加0.2%台盼蓝生理盐水溶液0.1ml混匀。用血细胞计数法计数瘤细胞总数和死细胞数。

瘤细胞死亡后，细胞膜通透性发生改变，细胞可被台盼蓝染成蓝色,而活细胞不着色。4748

计数计数板四角大方格内的细胞数,计数时对压边线的细胞,计左不计右,计上不计下。计数四个大方格内的细胞总数,然后按下列公式计算总细胞数和活细胞总数。

四大方格细胞总数－死细胞数活细胞数/ml悬液＝×稀释倍数×100004

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(3)接种：

腹水用含葡萄糖的无菌Hanks液稀释至适当的浓度,每只鼠腹腔注入0.1~0.2ml。整个操作应在60min内完成。50

3.白血病株的接种

腹水型白血病如L1210及P388的接种方法同腹水型肿瘤接种法。51

四、肿瘤细胞的冻存与复苏

为了使肿瘤细胞能得以长期使用，防止退化或变异，保存不同代细胞的特征，对肿瘤细胞或瘤株进行冷冻保存是很必要的。一般在液氮中冻存1~2年，细胞存活率可达80%~90%。

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1.冻存方法

取对数生长期增殖细胞，在冻存前一天最好换一次培养液。经胰蛋白酶消化、离心、洗涤，用含7份培养液、2份小牛血清、1份DMSO配成(1~5)×106个/ml的细胞悬液，转入细胞冻存管，贴上标签，注明细胞来源、名称及冻存日期。

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一般将冻存管:

①4℃--30min；－20℃--4h；－70℃--过夜--然后入液氮。

②可将冻存管悬挂液氮罐口处过夜，之后浸入液氮中。

③可用2cm厚脱脂棉将冻存管严密包裹,－20℃~－30℃过夜，然后除去脱脂棉直接放入液氮中。

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2.冻存细胞的复苏方法

从液氮罐中取出冻存管，迅速放入38℃~40℃水浴中，并不停摇动使其在1min内全部融化，500~800r/min离心5min，弃上清，加入培养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，以后按常规培养。

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细胞冻存及复苏的原则是“慢冻快融”，标准的冷冻速度是每分钟－1℃~－2℃，到－70℃以下时可迅速放入液氮中。所冻存的细胞必须是对数生长期的细胞，细胞密度应在106个/ml以上。56第四节人体肿瘤异种移植性肿瘤模型

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异种移植性肿瘤是移植性肿瘤的一种，近年很重视人体肿瘤的动物体内移植模型。因为这种模型使用人的肿瘤细胞，在组织形态和遗传特征等方面，均与人类肿瘤相同，故用这种模型可以比较直接研究人类肿瘤的生物学特性及抗肿瘤药物。58

由于异种移植的移植排斥反应常可导致移植失败，故选择适合的受体动物是移植成功的关键。常用的宿主动物主要有裸小鼠和C57BL/6小鼠，也可用免疫抑制剂或放射线等降低动物的免疫功能后，再进行移植。59

一、裸小鼠作为移植宿主

裸小鼠是在SPF屏障系统内繁殖生长的BALB/c裸小鼠，6~8周龄，体重21~22g。

[瘤源]人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类，一类是人的肿瘤细胞株(系)；另一类是源于人体肿瘤组织块的癌细胞。

常用人癌裸鼠移植的细胞株(系)、接种方式和最佳生长期见教材。

60

二、免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主

由于裸鼠娇弱，饲养条件要求高，费用昂贵，故用裸鼠复制人体肿瘤异种移植肿瘤模型较难普遍应用。使用免疫功能受抑制的大鼠接种人癌细胞，可获得人癌动物模型。先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy60Co全身照射。

61第五节抗肿瘤药物体内研究方法62

基本步骤是:低温保存瘤细胞—速融—加冷培养液洗除冻存液—用培养液将肿瘤细胞调至一定浓度—给特定动物(宿主)注射(ip或sc)。

肿瘤细胞在宿主动物体内增殖后—取出—给实验动物(受体动物)进行接种(荷瘤动物)。不同肿瘤的宿主动物、取用肿瘤的时间及接种方法见表4-1。63一、实体瘤(√)

[分组给药]

接种次日将动物随机分组：☉实验对照组(C)：接种肿瘤细胞不给受试药，只给受试药相应的溶剂☉受试药组(T)：设高、中、低3个剂量（给药1次或数次，给药途径应与推荐临床用药的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替）。

☉阳性对照药：对瘤株活性高的已知抗肿瘤药

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＊对S180,艾氏腹水癌实体型

可用环磷酰胺20~30mg/(kg.d)

＊对L615

可用5-氟尿嘧啶25mg/(kg.d)

＊对其他腹水型肿瘤一般用丝裂霉素2mg/(kg.d)

＊对W256

可用丝裂霉素4mg/(kg.d)+环磷酰胺20~30mg/(kg.d)65

[疗效评价]

停药24h后处死动物,称体重,剥离瘤块,称瘤重。受试药物对实体瘤的疗效以瘤重抑制率表示：

C－T

瘤重抑制率

(%)=×100%

C

式中T:受试药物组平均瘤重;C:实验对照组(模型组,荷瘤未用药动物)平均瘤重。(瘤重抑制率%=[(1－T/C)]×100%计算）66

观察瘤重抑制率时，要求实验对照组小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否则表示肿瘤生长不良，实验作废。

给药组动物平均体重下降（给药前后自身比较）不得超过15%，动物死亡数不得超过20%，否则表示受试药有毒性反应，应减少剂量重新实验。67

若中草药瘤重抑制率大于30%，合成药大于40%，且与实验对照组比较具有统计学意义，重复3次，疗效均稳定，则评定该受试药具有一定抗肿瘤作用。68

[注意事项]实验中如果几个药给药组共用一个实验对照组时，后者的动物数应适当增加,公式为:C＝G×M。式中C=实验对照组动物数；G=同时试验的化合物数或同时试验的药物数；M=给药组的动物数。如试验的药物数G为2，各给药组M均为10，故C＝2×10，实验对照组的动物数为20。69二、腹水型肿瘤(√)

[分组给药]于接种后次日将动物随机分组并开始给药，受试药设高、中、低3个剂量组，口服或腹腔注射给药，连续给药5~10次。70

[疗效评价]接种后观察和记录动物死亡时间和生存天数。实验对照组动物通常在2~3周内全部死亡。如实验对照组中≥20%动物存活超过4周，表明肿瘤生长不良，实验作废。如给药治疗期间实验对照组动物于7d内死亡率≥20%，表示肿瘤生长过快，实验失败。

71

腹水瘤以荷瘤动物的生命延长时间作为疗效指标，计算每组动物的平均存活时间，给药组与实验对照组的平均生存天数之比[(T/C)%]大于125%为有效。

在接种后60d分别记录给药组和实验对照组动物的平均生存时间(如果生存超过60d，按60d计算)，按下列公式计算生命延长率：

72

式中:T为受试药物组平均生存天数；

C为实验对照组平均生存天数。

T－C生命延长率(%)＝×100%

C73

若腹腔注射给药时生命延长率＞75%，非腹腔注射给药生命延长率＞50%，且与实验对照组比较具有统计学意义，重复3次，疗效稳定，则评定该受试药具有一定抗肿瘤作用。74

[注意事项]1.关于几个给药组共用一个实验对照组时,实验对照组的动物数，同实体瘤。2.实验开始及结束时应分别称动物体重，若给药组动物体重明显低于实验对照组时(如超过15%)，判定疗效时应注意体重降低对肿瘤生长的影响，排除非特异的毒性作用。3.腹水型肿瘤的研究方法,也适用于腹水型白血病，如L1210及P388。

75三、移植性肿瘤研究方法的应用

(一)肉瘤S180模型（实体瘤）(√)小鼠肉瘤S180(sarcoma180)是经典的动物肿瘤模型之一，在抗肿瘤药物体内筛选中被广泛应用。S180有实体型和腹水型两种生长形式，可以以一种形式传代，实体型与腹水型可互转。

76

[操作步骤]

1.

取接种在昆明小鼠约7~10d的S180肿瘤→剔除肿瘤包膜和坏死部分→置于玻璃匀浆器内→加入生理盐水配制成含瘤细胞为(1~2)×107/ml单细胞悬液→接种于同种异体小鼠腋窝皮下,每只小鼠注射0.2ml(含瘤细胞2×106~4×106个)。77

2.接种后第1d称体重、随机分组并开始给药,包括:

▲实验对照组

▲阳性对照药组（环磷酰胺,接种次日1次性ip,100mg/kg）

▲受试药高剂量组

▲受试药中剂量组

▲受试药低剂量组78

腹腔注射或灌胃给药.给药方案有多种。至接种后第11~14d,称量动物体重,解剖肿瘤并称重。79

[结果计算]

S180实体瘤生长速度与接种量成正比，一般重2.5g的肿瘤需生长8~11d。根据各组动物瘤重按前述公式计算瘤重抑制率，并进行药物疗效评定。80

[注意事项]

1.本方法也适用于B16、Hep、W256和C26等实体型移植性肿瘤模型。2.实验结束时,阳性对照组肿瘤基本不长或长得很小,即阳性对照组的抑瘤率应大于80%以上,而实验对照组动物在此期间瘤重应在2g左右。

81

3.受试药组动物体重不低于原始体重的20%,否则表示受试药剂量过高,需降低剂量重试。4.腋窝部皮肤松弛，皮下接种后能允许肿瘤生长得较大，也可接种于腹股沟部皮下。82黑色素瘤8384模型组阳性药组给药组85(二)大鼠W256癌肉瘤模型(×)瓦克癌肉瘤256（Walker256，简称W256）的生长有实体型和腹水型两种形式，并可互转。接种在皮下或肌肉内成为实体瘤,接种在腹腔则成为腹水瘤。在接种后开始给药治疗,实验结束后比较对照组与试验组的瘤重或大鼠平均存活时间,可判断受试药物的疗效。86

[操作步骤]

1.取接种于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d、接种于皮下11~13d的W256瘤,配制成瘤细胞悬液(约2×106~4×106个瘤细胞)。取体重55~65gWistar大鼠,雌雄不限,每次实验均用同一性别。每鼠大腿肌内接种瘤细胞悬液0.2ml,每组用6~10只动物。87

2.接种后第1d称动物体重,随机分组并开始给药,均用腹腔注射,每天1次,连续7~10d,至第8~11d处死动物,将双侧后肢从髋关节外剪下,分别称重,荷瘤肢体重减去对侧正常肢体重即为瘤重。88

[结果计算]按前述公式计算瘤重抑制率。[注意事项]

1.本方法也适用于S180及艾氏腹水瘤等肿瘤。

2.接种的瘤源有两种；用腹水型瘤源,传代6~8d的瘤源(抽出的腹水为血性);用皮下接种的瘤,用匀浆法制成瘤细胞悬液。

89

3.对照组肌肉型平均瘤重在3~5g;皮下肿瘤平均瘤重为3~12g;腹水型动物平均生存10~14d。4.第7d给药组动物存活率应大于65%,否则表明所试药物剂量过大。90

(三)Lewis肺癌模型(√)

1951年Lewis在未经过处理的C57BL小鼠肺发现了未分化上皮样肿瘤，此后建立了实体型移植性肿瘤模型。

91

[操作步骤]

1.取C57BL/6小鼠皮下接种8~12d的Lewis肺癌作为瘤源，无菌条件下剥离瘤组织，用剪刀剪成小块，用套管针移植或用玻璃匀浆器加无菌生理盐水(1:3)研磨成匀浆，过400目丝网，成单细胞悬液，计数每毫升匀浆液中的瘤细胞数。

2.给每只成年C57BL/6小鼠腋窝皮下接种2×106个细胞（0.2ml/只）。

92

3.接种后第1天进行动物分组并给药，阳性对照药用环磷酰胺50mg/kg体重(0.2ml/10g体重),隔日灌胃给药，共给3次。给药组每天灌胃给予受试药1次，实验对照组给予等体积生理盐水，连续10d。

4.末次给药后24h处死动物，称体重，剥离腋窝下肿瘤并称重，计算瘤重生长抑制率。

93皮下移植Lewis肺癌的C57BL/6小鼠94Lewis肺癌移植瘤95

[模型评价]Lewis肺癌恶性程度较高，受体鼠为C57BL/6小鼠，是目前国际应用较普遍的移植肿瘤模型之一，由于其接种部位的不同，用途比较广泛。本方法是评价药物体内抗肿瘤作用最常用的方法，对药物作用的预测性很好。

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[注意事项]1.实验开始和实验结束时应分别称量动物体重，如果给药组动物体重明显低于实验对照组（超过15%），判定药物疗效时应注意体重降低对肿瘤生长的影响，排除非特异的毒性作用。

2.肿瘤接种后2周，单个鼠瘤重应在500mg以上，否则说明肿瘤生长不良，肿瘤接种失败。

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3.对某些效价较低的药物，如未纯化中草药有效成分或多糖类的筛选，可将瘤细胞接种于后肢爪垫皮下，接种细胞数为(2~4)×105/0.02ml（细胞数仅为常规皮下接种量的1/3），接种后给药治疗，10d后从踝关节处切除带瘤的足称重，计算瘤重抑制率。若切除带瘤的足后继续给药，还可观察受试药对肺转移的疗效。98

(四)L1210白血病小鼠模型(×)L1210白血病最早是用甲基胆蒽在DBA/2小鼠诱发的，能在DBA/2小鼠及其杂交一代BDF1和CDF1小鼠体内生长。小鼠白血病L1210为腹水型肿瘤，是最常用的移植性肿瘤模型。

将1×105个腹水瘤细胞接种在DBA/2、BDF1或CDF1小鼠腹腔内，接种后24h开始给药治疗，实验结束后比较给药组与实验对照组小鼠的平均存活时间，可判断药物的疗效。

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[操作方法]1.取接种于DBA/2小鼠约7d的L1210腹水，用生理盐水配成瘤细胞数为106个/ml的细胞悬液，接种于BDF1或CDF1小鼠腹腔内，每只小鼠接种0.1ml（含瘤细胞1×105个）。100

2.实验当天接种动物，将瘤株进行细菌培养。接种后第1天检查培养情况，如无污染，将称量动物体重并随机分组后开始给药。接种后第2天再检查培养情况，如有污染，则实验报废。

动物分组包括实验对照组、受试药组及阳性对照药，均腹腔注射给药。给药方案有多种。第20天如果除阳性对照药组及受试药组外再无其他动物存活，则终止实验，评价结果。第30天处死全部动物，并评价受试药的疗效。

101

[结果]小鼠接种L1210后平均存活8~11d。一般观察30d，根据各组动物的平均存活天数，按公式计算受试药对L1210白血病小鼠的生命延长率（未死亡动物按30d计）。

102

[注意事项]1.本方法也适用于P388、EAC、Hep、W256和S180等腹水型移植性肿瘤模型。2.如瘤株培养证明被污染，需重新接种动物。

3.接种后第5天给药组动物存活率应大于65%，否则说明药物剂量过大或药物有毒性。4.如实验对照组动物在18d内仍未死亡，则认为肿瘤生长不良，接种失败，应分析原因重新实验。

103

(五)小鼠肾包膜下肿瘤移植模型(×)在裸鼠、BDF1或CDF1小鼠的肾包膜（肾纤维膜）下移植人的瘤细胞，由于移植的瘤块仅1mm3，可由肾包膜下丰富的血管供给营养和氧，瘤块能迅速增长，短期内(6~11d)肿瘤生长较规则，接种成活率接近100%。104

[操作方法]小鼠肾包膜下异种移植的肿瘤多选用人癌，其来源于裸鼠皮下接种传代16~22d的人癌瘤株、人癌培养细胞株或手术切除的新鲜癌组织。105

1.在无菌操作下取小鼠或人体瘤组织，剪去包膜及出血坏死部分，切成约1mm3小块。选用体重18~22g裸鼠、BDF1或CDF1小鼠，麻醉后手术区消毒，打开腹腔暴露左肾，将1小块瘤组织装入套管针内，移植于肾外侧中线处的包膜下。

106

2.在装有显微尺的体视显微镜下，测量起始移植块的长径(a)和短径(b)，测量后关闭腹部切口。如在肾包膜下注射培养的瘤细胞株，则注射含1×107个细胞的悬液0.02ml，不必测量移植瘤块的长短径。

107

3.接种次日分组、给药，每天给药1次，共5~10d。停药次日，即BDF1小鼠接种后6d或裸鼠接种后11d，称量体重，解剖带瘤肾脏，在体视显微镜下测量瘤块的长径(a)和短径(b)，按ab2/2公式计算瘤体积(V)。

4.肿瘤体积(V)也可以用下式计算：V＝(4/3)πabc＝(1/6)πABC，其中π为圆周率，ABC为肿瘤相互垂直的3个直径，abc为肿瘤相互垂直的3个半径。108109

[结果计算]根据每只鼠的瘤体积计算给药组瘤体积的相当率，表示受试药对肿瘤生长的抑制作用。如给药治疗后瘤体积较原接种瘤体积减小，表示肿瘤消退，受试药治疗有效，以消退率表示：

110

给药组平均瘤体积相当率（%）=×100%

实验对照组平均瘤体积给药后平均瘤体积消退率（%）＝

×100%

原接种平均瘤体积111

[注意事项]1.手术切除的人体肿瘤需冰冻运送，从取出肿瘤到接种应在4h内完成。2.注意无菌操作，瘤源如有污染，应终止实验。3.瘤块接种时应严格使每只鼠瘤块的长、短径控制在0.9~1.2mm。112

4.应严格控制饲养条件和环境，以免影响动物体重增长而产生非特异性抑瘤作用。5.若给药组动物体重下降至原体重的70%、实验终止时小鼠死亡率超过34%，表示受试药有毒性，应降低剂量重做实验。

113114第六节抗肿瘤药物体外研究方法

用体外细胞作抗癌药筛选具有用药量少,周期短,费用低等优点。体外筛选结果与体内试验的相关性好,因此,抗癌药体外筛选已作为常规的抗癌药初筛手段。体外研究方法

然而,体外研究方法也有一定局限性，主要是体内环境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，体外筛选的最大缺点是无法获得药物对组织选择性方面的资料。此外,有些药物须在体内代谢活化

(如环磷酰胺)或通过机体反应(生物调节剂)才能对肿瘤细胞起作用,因而不能通过体外筛选寻找。

体外研究方法

目前世界上已建立了很多体外癌细胞系(株)。药物筛选应选用生长特性稳定,增殖快,对已知抗癌药敏感的细胞系。小鼠与人的细胞系对药物的反应大致相同,前者具有在体内外均可进行试验的优点,故较常应用。体外研究方法

观察药物对肿瘤细胞体外生长的抑制作用，可选择10~15种以上肿瘤细胞系(株)进行体外研究，受试药用5个或5个以上不同浓度，观察药物对细胞形态、细胞存活、细胞膜功能、生长曲线、克隆形成能力等指标的影响。每项指标各有其优缺点，因此，应根据实际情况将几项指标组合起来应用。

体外研究方法

一、体外培养肿瘤细胞的生长和增殖特性细胞生长是指细胞体积的增大，细胞增殖是指细胞数目的增多。体外培养的细胞生长增殖到一定密度时，则需进行传代(passage)。细胞每传一代后，一般要经历潜伏期、对数生长期和停滞期3个阶段。

体外研究方法*

在指数生长期，取细胞数的对数与培养时间作图，可得一条斜率向上的直线，故也称此期为对数生长期，约3~5d

体外培养的肿瘤细胞按其生长方式可分为贴附生长型和悬浮生长型两大类:

贴附生长型:

细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，有时称贴壁生长。体外研究方法

悬浮生长型:

细胞在体外培养时不需要附着于支持物而在悬浮状态下生长，如取自血、脾或骨髓的培养细胞、血白细胞等。

二、MTT法

[基本原理]

MTT是一种溴化四氮唑,FW:414.3,是能接受氢原子的染料。MTT可进入细胞内，活细胞线粒体中脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臢,而死细胞则无此功能。甲臢的生成量通常与活细胞数成正比,在一定波长下用酶标仪测定吸光度值(A),即可定量测出细胞的存活率。MTT

[试剂与器材]

1.MTT溶液用生理盐水或PBS配制成5mg/ml贮存液，在磁力搅拌机上搅拌30min使之完全溶解。用前通过0.22μm滤膜除菌和沉淀物，4℃避光保存，两周内有效。呈黄色,无沉淀。暂时不用，可冻存。

2.含10%胎牛血清RPMI1640培养液，不含酚红指示剂；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析纯）,作为甲臢的溶解液。MTT

[试剂与器材]3.96孔培养板(用新的）,血细胞计数板，微量移液器，微型振荡器，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪。

MTT

[操作步骤]

1.选用对数生长期的贴附肿瘤细胞→0.25%胰酶消化→悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(完全培养液)→吹打成细胞悬液。

2.用台盼蓝拒染法检测,活细胞应在97%以上。若是悬浮生长细胞,可直接用台盼蓝排染法计数活细胞。MTT

3.96孔培养板每孔加入细胞悬液190μl，每孔含5000~40000个细胞(根据细胞的类型而定)。接种后，37℃、5%CO2预培养24h。

4.将受试药物配成终浓度的20倍。受试药可用DMSO、培养液或生理盐水溶解。可设5~7个浓度组。

MTT

5.加药组每孔加入10μl药液。因接种的细胞悬液体积为190μl，又加入了10μl药液，因此药液被稀释了20倍，等于所需要的终浓度。每组设3~5个平行孔，最好5个。

6.细胞在37℃、5%CO2培养箱中连续培养48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，继续培养4h。MTT

7.小心吸弃孔内上清液(若为悬浮培养的细胞，需1000r/min离心5min后再吸弃上清)。每孔加入150μlDMSO，微型振荡器上振荡约10min，使甲臢结晶完全溶解。

MTT96孔板用离心机8.设置对照组

：空白对照孔(调零孔)：培养液、MTT和DMSO。实验对照组：细胞、相同浓度溶解药物的溶剂

+

培养液、MTT和DMSO

加药组

：细胞、受试药物+培养液、MTT和DMSO阳性药对照组:细胞、阳性药+培养液、MTT和DMSO

（操作步骤同加药组）MTT9.用酶标仪在570nm波长测定每孔的A值(参考波长450nm)。测定时以空白对照孔调零。应尽快完成测定。MTT[结果评定]按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

实验对照组平均A值－加药组平均A值肿瘤细胞生长抑制率(%)＝×100%

实验对照组平均A值

MTT

以同一样品的不同浓度药物对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线,从中求出该样品的半数抑制浓度IC50MTT[评价]

本方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。该方法的特点是灵敏度高、重复性好、经济、操作简便、易实现自动化、无放射性污染，且与其他检测细胞存活的方法（如细胞计数法、克隆形成试验和3H-TdR掺入试验等）有良好相关性。

MTT

[注意事项]1.MTT被活细胞中脱氢酶还原所形成的结晶产物不溶于水，需加入有机溶剂溶解后才能测定A值，选择不同的有机溶剂或结晶产物溶解不完全，对结果有一定影响。

2.酶标仪滤光片的选择甲臢的吸收峰受一些因素的影响，如溶解甲臢的溶剂、pH等。因此，首先应用优质分光光度计测定实验对照组的最大吸收峰，在此基础上选择合适的滤光片。MTT3.细胞系的选择及接种的细胞数由于实验应设计在活细胞数与A值呈线性关系部分进行，故应选用在4~7d生长速度适合作此项分析的细胞系。选择适量接种细胞数的原则是，实验对照组的细胞在实验结束时的A值与活细胞数之间仍处于线性范围（一般A值在0.2~2.0之间）。

4.甲臢的生成不仅与活细胞数成正比，也受加入MTT后作用时间的影响，即A值可随着放置时间而改变。

MTT5.培养液中的酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加剂可使A值增高。在进行MTT法测定时应先将这类物质洗去。6.培养液中的血清可使A值增高，影响测定结果。解决方法：①应用低于10%的胎牛血清，②加入DMSO之前尽量吸去孔内残余上清液，③用10%SDS盐酸溶液代替DMSO。

7.如用DMSO溶解受试药，DMSO终浓度应低于0.5%。

MTT▲关于每孔的细胞数——预先摸索▲关于边缘效应——四周的孔只加PBS▲关于测定波长——570nm？490nm？(460~630nm)

(460,503,540,570,590,630nm)▲在4℃存放的试剂，MTT、DMSO等用前室温平衡30min▲所用试剂要先除菌处理MTT三、XTT法

[基本原理]XTT是MTT的衍生物,FW:673.5。当XTT与电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯(PMS)同时使用时，XTT可被活细胞内线粒体脱氢酶还原形成水溶性棕黄色代谢产物，其生成量与活细胞的数量呈正相关，在450nm波长处有较大的吸收峰。在一定范围内吸光度(A)与活细胞的数量呈线性关系，用酶标仪测定代谢产物的A值可反映活细胞的数量。

XTT[操作步骤]1.取对数生长期培养细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的培养液配制成密度为1×104个/ml细胞悬液。96孔培养板每孔加细胞悬液100μl，再每孔加入不同浓度受试药物(每个浓度设3个以上复孔)10μl，37℃、5%CO2培养箱温育48h。

XTT2.受试药物处理48h后，96孔培养板的每孔加50μlXTT-PMS应用液(内含50μgXTT、0.3825μgPMS)，37℃继续培养2~4h。3．用微型振荡器振荡培养板2~3min后，使染料分布均匀，用酶标仪在450nm波长测定A值。[结果评定]

同MTT法。

[注意事项]XTT法尤其适用于悬浮培养细胞的研究。本方法的优点是加入XTT后由于代谢产物溶于水，勿需吸去上清液即可测定A值，更简便快捷。

2.XTT不如MTT那样容易被线粒体中脱氢酶还原，因此必须同时加入电子偶联剂PMS。

3.XTT-PMS应用液需预温至37℃才能加入培养板内。4.XTT的终浓度为0.297mmol/L，PMS终浓度多用5~25μmol/L，一般后者终浓度为5μmol/L即可获得满意结果。每孔加入的XTT量不宜过多，若XTT超过75μg/孔，可使A值下降。当每孔培养液超过100μl时，XTTPMS应用液的加入量也要相应增加。

5.XTT水溶液不稳定，加入PMS后更不稳定，因而XTT-PMS应用液一定要临用前新鲜配制。一般在XTT中加入PMS并混匀后，应立即加入到96孔板内。

6.由于XTT法灵敏度高，每孔接种的细胞数不宜过多(通常为5000个/孔)。但有些细胞代谢活性低，如淋巴细胞、角质细胞和黑色素细胞等，每孔接种细胞数需增加至2.5×105个，以获得较多的代谢产物。四、WST-8法

[基本原理]

WST-8是四唑单钠盐。CCK-8试剂所含的WST-8在电子载体1-甲氧基-硫酸吩嗪甲酯(1-methoxyPMS)作用下，被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为水溶性黄色甲臢。细胞内生成的甲臢数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖测定、细胞毒性分析和抗肿瘤药物筛选等。

[操作方法]1.选用对数生长期贴附生长肿瘤细胞，用胰酶消化后，悬浮于含胎牛血清的培养液中，轻轻吹打使成细胞悬液。

2.96孔培养板孔内加入细胞悬液100μl，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞接种后贴附需2~4h，如不需要贴附，可以省去此步骤。

3.每孔加入不同浓度的受试药物，设相应对照组，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养。加入药物后的培养时间，依药物的性质而定。

4.每孔加入10μlCCK-8试剂，轻轻振荡使试剂与培养液混匀。

5.在37℃、5%CO2培养箱中继续培养1~4h。由于细胞种类不同，形成的甲臢量也不同。如果显色不足，可以继续培养，以确认最佳培养时间。6.用微型振荡器振荡培养板使颜色均匀后，用酶标仪在450nm波长测定A值(参考波长655nm)。测定时需减去空白对照组(孔)的A值（不含细胞的培养液中加入CCK-8试剂）。

[结果评定]

同MTT法。

[注意事项]1.本法采用单一试剂，操作简单，敏感性高，重复性好。

2.CCK-8试剂在4℃、避光条件下可保存1年。如需长时间保存，应置于－20℃。CCK-8试剂应避免反复冻融，经常使用可将试剂置于4℃冰箱。3.由于每孔加入的CCK-8试剂的量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而导致误差，故在加完试剂后应轻轻敲击培养板以助混匀。也可以用培养液适当稀释CCK-8试剂，混匀后加入。4.与贴附生长的细胞相比，CCK-8试剂用于悬浮生长的细胞显色比较困难。可通过延长加入CCK-8试剂后的培养时间或增加细胞数量来解决。

5.加入的受试药物如果具有还原性，会与CCK-8试剂反应，可增加吸光度。6.关于不同种类细胞的适宜接种细胞数、培养基及其用量、CCK-8试剂的用量以及加入CCK-8后的培养时间等，可参考生产商日本同仁化学研究所提供的资料。7.AlamerBlue是近年美国BiosourceInt公司开发的一种水溶性染料，其用途与CCK-8试剂相似。五、磺基罗丹明B法

[基本原理]磺基罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)是一种粉红色蛋白质结合染料,含二个磺基,可溶于水。在酸性环境下,SRB能与三氯醋酸(TCA)固定后细胞内大分子中的碱性氨基酸结合,被结合的染料的量在一定范围内与活细胞中蛋白质的量成正比,而蛋白质的量与细胞的数量成正比。因此,可根据染色强度推测活细胞数。

MTT法的一个缺点是A值可随放置时间而改变,而SRB法无此现象,因此,更适用于进行大规模试验。[操作步骤]1.用96孔培养板进行操作。细胞接种、培养、加药及药物作用时间等均同MTT法，空白对照组只加入完全培养液，不加细胞。2.受试药物处理细胞48h后，不除去培养液，96孔板每孔加入预冷的50%TCA液50μl(终浓度为10%)固定。悬浮培养细胞则加入80%TCA液50μl(终浓度为16%)。

加入TCA时必须轻轻地加在培养液的表面，静止5min后再将培养板移至4℃放置1h，使细胞固定在培养板的孔底。同时在加药的即刻将部分接种的细胞用TCA固定，测定此时细胞的A值（T0）。

3.弃固定液,用去离子水洗5次，甩干,空气干燥.4.用1%醋酸配制0.4%SRB溶液。每孔加入100μl,室温染色30min.然后用1%醋酸洗5次,洗去未与蛋白结合的SRB,干燥。

3.吸弃含TCA的培养液，用去离子水洗板5次，甩干，空气干燥至无湿迹。

4.用1%醋酸配制0.4%SRB溶液。每孔加入SRB液100μl，室温染色15~30min。然后用1%醋酸洗涤5次，洗去未与蛋白结合的SRB，空气干燥。

5.每孔加入10mmol/LTris液（pH10.5）150μl。用微型振荡器振荡使SRB完全溶解。

6.用酶标仪在490或540nm波长测定实验对照组A值及加药组A值，测定时用空白对照孔调零。

[结果评定]1.可按MTT法的计算公式，计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率。

2.规定对照组的A值为C,加药组的A值为T,药物作用0时的A值为T0,即刚刚加药,药物尚未发挥作用时的A值。如果T≥T0,说明肿瘤细胞在加药后仍然生长：

(T－T0)

生长率(%)＝×100%

(C－T0)例如：T=2.0,T0=0.4,C=6.0(T＞T0)(2.0－0.4)1.6

生长率(%)＝×100=×100=28.6%

(6.0－0.4)5.6如果T＜T0,说明加药后细胞被杀伤：

(T－T0)

杀伤率(%)=×100

T0

(0.4－0.8)

杀伤率(%)=×100=－50%

0.8[注意事项]1.空白A值的高低与TCA的固定时间、培养液的血清浓度有关,固定时间越长,血清浓度越高,空白A值越大。2.对于大多数细胞而言,用490~530nm波长测定A值,效果均可。◎目前可应用MTT法的公式，直接计算瘤细胞生长抑制率

3.本法用TCA固定细胞后,可随时用SRB作蛋白含量测定,不受测定时间影响。SRB用Tris溶解后也可稳定一个较长的时期。

4.A与SRB浓度作图时，在A单位1.5~2.0之间为线性,当超出线性范围时,必须稀释后重新测定。六、克隆形成试验

克隆形成试验（clony-formationtest，也称集落形成试验）是评价抗肿瘤药物作用的简便、可靠的体外方法，目前较为常用。

[基本原理]

克隆(clone)是指一个细胞在特定条件下培养增殖而产生的细胞群.单个细胞能连续分裂6代或以上时,其后代所组成的群体即集落,凡一个集落超过50个细胞者即为一个克隆,大小在0.3~1.0mm,能形成克隆的细胞称克隆原细胞(干细胞)。肿瘤细胞的生长、转移、复发均以干细胞的增殖为基础。

当接种的细胞分布较稀疏时，每个克隆彼此不接触，通过克隆计数，可对单个细胞的增殖能力进行定量分析，故能较灵敏地检测药物的抗肿瘤活性。

克隆形成试验可分为两种:

•平板克隆形成试验

•软琼脂克隆形成试验

(一)平板克隆形成试验是指在培养皿上观察克隆形成，该法适合于贴附生长的培养细胞，如口腔癌KB、B16等。

[操作步骤]1．取生长良好的贴附生长细胞1瓶，瓶口过火后弃去培养液，用PBS洗1次。

2．用胰蛋白酶消化5min左右，在显微镜下观察细胞呈球状时，加入含10%小牛血清的培养液。

3．1000r/min离心10min后收集细胞，用含10%小牛血清的培养液制成单细胞悬液，并调节至每1ml含60个细胞。4．取5ml单细胞悬液注入直径60mm塑料培养皿中，每皿含300个细胞。以“十”字方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散铺满培养皿后，将培养皿置于5%CO2培养箱37℃过夜。

5．在倒置显微镜下观察细胞贴附和分布情况，若贴附良好，分布均匀，弃去培养液即可加入5个以上不同浓度的受试药(一般用含10%小牛血清的培养液配制)，每个浓度至少3皿，受试药与细胞作用一定时间(2~24h或更长)后，弃去含药培养液。6．用新配制的培养液漂洗3次后，加入无药含血清培养液，静止培养至10~12d,即可进行克隆计数。

7．计数前弃去培养液，用PBS洗涤l~2次，加入新配制的甲醇-冰醋酸液(3/l)3~5ml固定10min，弃去固定液。待稍干燥后加入10%Giemsa染色液染色约20min，当克隆明显着色时，用水洗去染色液。以含50个细胞以上的细胞团作为一个克隆，在20倍解剖显微镜下进行克隆计数。

[结果评定]

按下述公式计算克隆形成率和克隆形成抑制率：

克隆数克隆形成率（%）＝×100%

接种细胞数

加药组平均克隆数克隆形成抑制率（%）＝（1－）×100%

实验对照组平均克隆数

一般以克隆形成抑制率与剂量的对数作图,得出一条S形曲线即剂量反应曲线,并求出药物的半数抑制浓度(IC50),受试药的IC50小于10μg/ml时值得进一步试验.

[注意事项]

1.细胞悬液中的细胞应充分分散,单个细胞至少在90%以上,否则试验误差大。

2.在培养早期不要晃动培养皿。

3.实验对照组（不加药物仅加生理盐水）的克隆形成率应在40%~60%。

4.若待试药为中药粗制剂,如水煎剂,醇提液,应用含药血清。

(二)软琼脂克隆形成试验

悬浮生长的细胞必须在软琼脂培养基内增殖才能形成克隆。当然,很多贴壁生长的细胞也能在软琼脂中形成克隆。本方法适用于L1210、HL-60、B16、KB细胞。

软琼脂克隆形成法通常在塑料培养皿中进行，由两层琼脂构成：

上层为接种层，含细胞，琼脂浓度为0.3%~0.4%

下层为铺底层，琼脂浓度为0.5%~1.0%

上层软琼脂可使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑可防止细胞贴附生长。细胞增殖形成的克隆形态有块状、盘状和蘑菇状等。

[操作步骤]

1.将5g精制琼脂(specialagar)加到盛有100ml双蒸水的瓶内，瓶内壁不要粘挂琼脂颗粒，68kPa(115℃)高压灭菌15min。趁热取出后振荡均匀，置50℃水浴中降温，降至50℃时备用。2.取对数生长期细胞1瓶，进行活细胞计数，用含15%小牛血清RPMI1640培养液配成每毫升含1000个细胞的悬液，置37℃预温。根据实验要求可作稀释。

3.取35mm培养皿若干，3个为一组，加药组各加入不同浓度的受试药物（20μl/皿），实验对照组加入等体积的相应溶剂。药物作用一定时间后，弃去含药培养液。

4.铺底层琼脂取在操作方法1中制备的5%琼脂液1份，迅速加到9份37℃含15%小牛血清的新鲜RPMI1640培养液中(0.5%琼脂)，摇匀后立即加入平皿中，每皿1ml，室温水平放置使琼脂充分凝固。

5.铺上层琼脂取预温37℃的细胞悬液9.4ml，移入小烧杯中，加入50℃的5%琼脂0.6ml(0.3%琼脂＋细胞)，迅速混匀，加到底层琼脂的上面，每皿1ml，室温水平静置使软琼脂凝固。

6.将平皿置于密闭的盒中，放入5%CO2培养箱37℃培养7~10d。7.在16倍解剖镜下计数直径大于75μm(50个细胞以上)的克隆。

8.按平板克隆形成法的公式计算克隆形成抑制率，判断受试药物对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用。

软琼脂克隆形成

[结果评定]

1.按平板克隆形成试验的公式计算克隆形成抑制率，以克隆形成抑制率对受试药物剂量的对数作图，可得到一条S形曲线，从中可求出受试药物的半数抑制浓度IC50。

2.当受试药的IC50﹤10μg/ml(或10-5mol/L)时，表示该受试药值得进一步研究。

七、染料拒染试验法

[基本原理]活细胞有排斥某些染料如台盼蓝、伊红、苯胺黑等的能力,而死亡的细胞由于膜完整性破坏,可被着色。

[操作步骤]

1．选用对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成5×104个细胞/ml的悬液，分装在培养瓶中，加药组加入不同浓度的受试药，实验对照组加入等体积溶解受试药的溶剂，在含5%CO2的37℃培养箱中培养3~4d。

2.取细胞悬液(贴壁细胞先用胰蛋白酶消化)0.4ml,加入0.4%台酚蓝液0.1ml,在室温作用5min,在15min内用血细胞计数板计数200个细胞。未染色的是活细胞,染蓝色是死细胞。分别计数染色细胞数和未染色细胞数，求出细胞存活率。

未染色细胞数细胞存活率（%）＝×100%

细胞总数

[结果评定]

1.实验对照组为未经任何处理的培养细胞，细胞存活率应在95%以上。在观察药物对肿瘤细胞作用时，可对加药组和实验对照组分别计数活细胞数，求得每毫升细胞数，再用下列公式求出细胞生长抑制率。

实验对照组活细胞数－加药组活细胞数细胞生长抑制率（%）＝×100%

实验对照组活细胞数

2.以细胞存活率对药物浓度的对数作图，可得一条S形剂量反应曲线，从中求出半数杀伤浓度（LC50），当LC50﹤10μg/ml并能重复时，应做进一步研究。

[注意事项]

1．由于下列原因，可能低估药物抑制肿瘤细胞生长的作用：①受致死损伤的细胞，细胞膜完整性的破坏可以在药物作用后3~4d后才表现出来，在此期间存活细胞可能继续增殖，使活细胞数增多；

②某些受致死损伤的细胞可能过早地崩解，细胞计数时已不存在，使着色细胞比例下降。因此，这一方法不太适合于仅抑制细胞分裂或使细胞增殖死亡的药物，比较适合于可使细胞间期死亡的药物。2.细胞悬液与台盼蓝染色液混匀后，应在15min内计数完毕，时间过长，会引起细胞膜通透性增加，影响结果。

八、细胞生长曲线法

[基本原理]

在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数（Y轴）对培养时间（X轴）作图，可得一条斜率向上的直线。但随着培养时间的延长，细胞密度不断增加，由于代谢产物的堆积及营养物质的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，生长曲线的斜率逐渐变平，进入平台期。因此，药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。

[操作方法]

以悬浮生长细胞为例。

1.选用对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养液配成1×104个细胞/ml的悬液，在25ml培养瓶中接种5ml。加药组加入不同浓度的受试药物50μl，实验对照组加入等体积溶剂。

2.细胞置37℃、5%CO2培养箱中培养，在培养后即刻及1、2、3、4、5、6和7d分别取样40μl，加0.4%台盼蓝染色液1