细胞产物分析技术-吸光光度法-2012

吸光光度法基本原理仪器简介灵敏度与准确度分析条件的选择应用简介基本原理吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。光的电磁波性质射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光基本原理光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关。物质对光的吸收物质对光的吸收满足Plank条件hS2S1S0S3E2E0E1E3hhh基本原理吸收光谱AbsorptionSpectrum纯电子能态间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子内电子跃迁带状光谱锐线光谱A基本原理物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。例：A物质B物质同理，得：1ev=1.610-19J.基本原理透光率（透射比）Transmittance透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It基本原理T：透光率A：吸光度Lambert–BeerLaw基本原理b：吸光液层的厚度，光程，cmc：吸光物质的浓度，g/L,mol/LK：比例常数K

K

ac：mol/Lc：g/L吸收定律与吸收光谱的关系AC吸光定律A或吸收光谱AC

max基本原理吸光的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即对吸收定律偏离AC主要原因非单色光吸光质点的相互作用基本原理吸光分析法目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高光电比色法UltravioletVisualSpectroscopy0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品入射光I0透射光It仪器简介紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯，氘灯，185~350nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光栅，反射光栅玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示仪器简介单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示仪器简介单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器仪器简介灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达10-3~10-4g/L或~g/mL数量级。准确度能满足微量组分测定的要求。一般相对误差2~5%。例如，石灰石中微量铁，含量为0.067%，相对误差以5%计算，结果为0.064~0.070%，绝对误差为0.003%灵敏度与准确度对同一种待测物质，不同的方法具有不同的，表明具有不同的灵敏度。例，分光光度法测铜铜试剂法测Cu426=1.28104L．mol-1．cm-1双硫腙法测Cu495=1.58105L．mol-1．cm-1一般情况<104

~104~105

>105低灵敏度中等灵敏度高灵敏度灵敏度不同的本质原因是什么？灵敏度与准确度根据误差传递公式，推导出浓度测量的相对偏差为T=0.368=36.8%A=0.434为了减少测量误差，控制溶液的吸光度A=0.15~1T=70~10%误差公式推导0.368灵敏度与准确度测定波长的选择无干扰，选择max有干扰AA待测溶液吸光度的选择控制A=0.15~1T=70%~10%方法选择C选择b1、非单色光影响小2、灵敏度高灵敏度与准确度参比液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-Rmax试液 显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测M-R的吸收maxA（样）=A（待测吸光物质）+A（干扰）+A（池）A（参比）=A（干扰）+A（池）灵敏度与准确度分析条件的选择显色反应有机物质官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度332+桔红色max邻二氮菲酸度的影响副反应M+nR=MRnOH-H+存在型体的变化RH=R-+H+

12生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色分析条件的选择酸度的选择可得适宜pH范围实际工作中，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。ApHM+nR=MRnOH-H+分析条件的选择显色剂的用量M+nR=MRn实际工作中，作A~CR曲线，寻找适宜CR范围。ACR分析条件的选择应用简介微量组分的测定单组分的测定多组分的测定介绍一种解联立方程法AXY12根据加合性原则解联立方程，可求得Cx,Cy为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。请设计一个测定两组分的浓度的实验方案ACs(x)纯物质或共存物质不干扰单组分的测定微量铁的测定氨基酸的测定邻二氮菲法茚三酮法蛋白质的测定考马斯亮蓝法总磷的测定磷钼蓝法海水中营养盐的测定返回应用简介示差光度法常规法以空白溶剂为参比示差法以浓度