植物种质资源离体保存

第十二章植物种质资源离体保存植物种质资源离体保存的概念和意义保持生物多样性(biodiversity)是一个国际性备受重视的问题。被丧失，而种质资源是植物育种工作的根底，因此，搜集和保存种质资源已受到世界各国的重视。(insituconservation)和非原生境保存(exsituconservation)，后者(试管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明显的重要性，但要保存大量种质，则需消耗巨大的人力、物力和土地，在实际上很难实施，而且易受自然灾难、虫害和病害的侵袭，造成植物存；③承受无性生殖来保持其优良性状的植物(如很多果树)，用种子生殖后代会发生变异；④〔依据枯燥对种子生命力的12这类种子也不能在低温下贮藏。生长在热带的藤黄科、山榄科、龙脑香科、番荔枝科、无患子科、马钱科等植物都是这类种子〕植物不宜用种子保存或保存难度很大；⑤易遭自然灾难攻击而丧失。2060种质资源的离体保存(germplasmconservationinvitro)是指对离体培育的小植株、在超低温保存中，也常常直接承受植物茎尖或分生组织、胚、花粉等材料作为保存材料。离体种质保存有以下优点：①所占空间少，节约大量的人力、物力和土地；②便于种质资源的沟通利用；③需要时，可以用离体培育方法很快大量生殖；④避开自然灾难引起的种质丢失。固然，离体种质保存也有一些值得留意的缺乏之处：①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培育；②易受微生物污染化和再生力量的逐渐丧失。70年月以来，人们把冷冻生物学(cryobiology)和植物离体微繁结合起来，进展了离体种质资源冷冻保存(freezingconservationinvitro)或超低温保存(cryopreservation善，已经或正在建立离体种质保存库。植物种质资源离体保存的方法限制生长保存限制生长保存利用限制离体培育物的生长速度来保存种质的方法慢的速度生长。这样，转移继代的间隔时间可延长。但应用这些方法细胞学、遗传学和生产性状的鉴定。低温保存法低温保存(lowtemperatureconservation)是限制生长应用最广l～9℃(10～20℃)下培育，并常常同时提高培育基的渗透压。在这种条件下，培育物的生长受到限制，继代培育时间间隔数个月至1温(正常)下培育，即可快速恢复生长。高渗透压保存法2％～410％左右，就可到达抑制培育物生长的目的。提高培育基的渗透压还可承受外加甘露醇、山梨醇等惰性物质2％～32％～5％的甘露醇处83％甘露醇，均可高渗透压。生长抑制剂(或延缓剂)保存法长抑制剂—ABARNA制DNA生长抑制剂。降低氧分压保存法

)、多效唑等人工合成的植物9压太低，则会产生毒害作用。枯燥保存法水是生命活动的基质，降低培育物水分，其生命活动就能延缓，4～7d)，然后置于加生长延缓剂或限制蔗糖的条件下保存。在不含蔗糖2恢复生长快，适于现代化种质库的治理。值得一提的是，离体保存植物种质时，不同植物、不同基因型或同一品种的不同材料，所承受的上的保存方法结合使用，更有助于延长不同植物的保存年限。超低温保存植物超低温种质保存的概念2070和Street氮中保存后能恢复生长，从而导致了种质资源超低温保存法的进展。法处理后在超低温(一196℃液氮)条件下进展保存的方法。目前，承受茎尖、猕猴桃茎尖、薯蓣茎尖、马铃薯茎尖、苹果根尖、甘薯茎尖等。超低温保存的根本原理氮中(－196因而排解了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。低温冰冻过程中假设生物细胞内水分结冰细胞构造就会遭到不行逆的破坏导致细胞和组织死亡植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进展细胞分裂和分化就是在冰冻过程中避开了细胞内水分结冰并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而到达植物材料保存目的但是植物细胞含水量比动物细胞高在冷冻(freezing)过程中会有冰晶形成和过度脱水，在解冻(thawing)过程中也会重形成冰晶和患病温度冲击(thermalshock)，保存难度大。假设直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。因此，植物种质超低温保存必需实行如下措施：①选择细胞内自由水少抗冻力量强的植物材料；②实行一些预处理措施，提高植物材料的抗冻力量；③在冷冻过程中尽量削减冰晶的形成避开组织细胞过度脱水；④在解冻过程中避开冰晶的重形成以及温度冲击导致的渗透冲击 (osmoticstress)等。超低温保存的根本程序料(培育物)的选取、材料的预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻、再12－1)。假设操作不当，保存就会失败，因此，必需把握好整个技术程序的各个环节。12－1植物离体材料超低温保存的根本程序植物材料(培育物)选取已经争论或应用过的植物材料或培育物主要有三类：①愈伤组幼龄植株。冻性强的离体培育物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关遗传不稳定现象，在现有的技术条件下，尚无有效的掌握措施，并且用茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株等有组织构造的离体材料，由于其遗传稳定性好，易于再生，且细胞体积小、液泡小，含水量较低，细保存材料。生长。幼小的球形胚比老龄胚存活率高。材料预处理的比例。由于分裂细胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易有大冰晶形成，细胞不易受害。的离体培育物进展低温预处理和低温预处理是将离。冷冻前或冷冻期间，由于细胞脱水，导致细胞内可溶物的浓度在(DMSO)、脯氨酸、糖类、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。对植物来说，DMSO是最好的防5％～8％。解冻后的存活率。愈伤组织来说，加速继代可提高小细胞的频率。然后，把茎尖或细胞0℃的条件下培育数日。冷冻处理(slowcoolingmethod)(fastcoolingmethod)、预冻法(pre-freezingmethod)和干冻法(dry-freezingmethod)。慢冻法个低温的过程。慢冻法是分步进展的，其根本操作为：先以1～5℃-30～-40℃或-1001h196℃)保存。形成冰晶，即使是体积较大、含水量较高的植物材料，也可以得到较浮培育物尤其适用，但要求严格掌握降温速度。快冻法快冻法是对预处理过的材料以100～1000℃／min196℃成的冰晶体没到达使细胞致死的程度。一些植物的离体种质，如草莓、马铃薯、奢蓣、苹果根尖等。预冻法预冻法是将植物组织放人液氮前，先经几个阶段的预冻，如-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃，然后再转入-196℃液氮中。此法已较少使用。干冻法干冻法是把样品放人烘箱内或真空中，使其脱水(dehydration)，提高其抗冻性，然后再放人液氮中保存的方法。不活率。冷冻贮存在冷冻贮存期间，由于液氮在不断挥发，所以，必需定时补充液-196℃下的材料要长期贮40002ml20～25L随着贮存时间的延长，细胞活力会有肯定的下降。因此，这项技术仍需改进。解冻。解冻的速度是解冻技术的关键，解冻可分为快速解冻(fastthawing)和慢速解冻(slowthawing)两种方法。解冻的速度慢，细胞内简洁发生再结晶，导致细胞死亡；速度快，再结晶的过程来不及发生，细胞存活率高。快速解冻法快速解冻法就是把冷冻的材料取出后，快速放入35～40℃(该温度下解冻速度一般为500～700℃／min)温水浴。慢速解冻法02～3℃的低温下渐渐溶化。少数超低温保存的材料只有承受慢速解冻才能存活，料死亡。因此，解冻速度的选择应参考冷冻速度。2.2.3.5进展培育，应将融解后的样品直接置于琼脂培育基上培育，l～2胞在冷冻过程中渗漏出来的某些重要物质被洗掉了的原因。当重培育曾在-196℃GA3

以后，冷GA

，茎尖则3GA3

就能直接长成小植株。此外，参加活性炭可以显著提高经过冷冻和解冻的胡萝卜试管苗的总的存活率。100％，因而需要测定培育物活力，以剔除没有生活力的培育物。测定方法有FDA〔荧光素双醋酸酯〕染色法、TTC〔氯化三苯基四氮唑〕复原法、EvansBlue20％～80％之间。(2℃)熬炼过的金冠和富士苹果的茎尖，超低温保存后成活率可达80Diosc