过氧化氢酶km值是多少

本文格式为Word版，下载可任意编辑——过氧化氢酶km值是多少篇一：过氧化氢酶动力学常数测定

测验工程二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓名：

赵家熙指导教师：

谭志文测验室：

6503组员：①章恒炯②③劳绩：

第三片面：测验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158（2）Na2C2O4质量数：134（3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：测验（1）0.65

测验（2）0.50对照（1）1.45对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mLKMnO4溶液相当于多少mgH2O2）

1.7

2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mgH2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min

二、动力学常数的测定（一）原始数据

（二）求出各管回响前的底物浓度[S]0和回响速度

V0

（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）

1/s1/v

200111.1

149.280.6

121.979.3

8045.1

4021.2

（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）

Km11??vv[S]v如（三）中图

maxmax

y=0.5572x+1.5829x=0时y=1/Vmax

y=0时x=-1/Km

Km=0.35Vmax=0.63

第四片面：课后研讨题

1.总结本测验操作过程的留神事项。

1酶的提取和存放一般在0-4℃下举行。

2每个三角瓶内的酶促回响时间要精确操纵在5min。

3各回响瓶的滴定终点微红色为同一标准。

4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中理应保证逐滴参与。

2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?

1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。

2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。

3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

R(Fe2+)+H2O2=R(Fe3++OH－)R(Fe3+OH－)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2

4.在回响速度的测定中，参与硫酸有哪些作用？

终止回响,为下一步的滴定供给酸的环境。

5.米氏方程中的Km有何实际应用？

米氏常数是酶促回响速度n为最大酶促回响速度值一半时的底物浓度。可用于判断回响级数；

判断是否为不同种酶；

判断酶的最适底物；

确定酶活性测试时所需底物的浓度。

6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？

当ν=Vmax/2时，Km=[S]。Km值是酶促回响速度为最大速度一半时的底物浓度。

Km值对某一特定酶来说是个常数。一半根据酶的Km值来判断这些酶是否是完全一致的酶，或是催化同一回响的一类酶。

Km值越大，酶与底物亲和力越小；

Km值越小，酶与底物亲和力越大。

7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内举行？

进程曲线是在酶回响的最适条件下采用每隔确定时间测产物生成量的方法，以酶回响时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随回响时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的回响速度下降。回响速度随回响时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆回响加强等理由所致。

8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有猛烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使

回响溶液吸光度(A240)随回响时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的测验。

测验概要

本测验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。

主要试剂

0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

主要设备

紫外分光光度计；

离心机；

研钵；

250ml容量瓶1个；

0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；

10ml试管3支；

恒温水浴。

测验步骤

1.酶液提取：称取崭新小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，参与2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合平匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表依次参与试剂。

表紫外吸收法测定H2O2样品液配置表

25℃预热后,逐管参与0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立刻记时，并急速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

篇二：测定过氧化氢酶Km

测验一过氧化氢酶Km的测定

本测验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化以下回响：

?????2H2O+O2↑2H2O2?过氧化氢酶

H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。

2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4???2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O

求出回响前后H2O2的浓度差即为回响速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。

1．0.05mol/L草酸钠标准液将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，

切实称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，参与浓H2SO45ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。

2．约0.02mlKMnO4储存液称取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用外观皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。

3．0.004mol/LKMnO4应用液取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都务必重新标定储存液。

4．约0.08mol/LH2O2液取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/LKMnO4标定之，稀释至所需浓度。

5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。

l．血液稀释吸取崭新（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。

2．H2O2浓度的标定：取清白锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O22.0ml和25%H2SO42.0ml，分别用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。

3．回响速度的测定：取枯燥清白50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。

参与物(ml)H2O2(约0.08mol/L)

蒸馏水

10.503.0

21.002.50

31.502.00

42.001.50

52.501.00

将各瓶置37℃水浴预热5min，依次参与1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加

边摇，持续保温准5min，按依次向各瓶加25%H2SO42.0ml，边加边摇，使酶促回响立刻终止。

结果用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。

1．回响瓶中H2O2浓度(mol/L)?

H2O2mol浓度?参与H2O2ml数

4

?

H2O2mmol数

4

（式中：4为回响液量4ml）2．回响速度的计算：以回响消耗的H2O2mmol数表示。

回响速度=参与的H2O2mmol数－剩余的H2O2mmol数

即：H2O2mol浓度×参与的毫升数－KMnO40.004mol/L×消耗的KMnO4毫升数×5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2回响中mol换算系数）3．求Km值：

下面引用一次测验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。

己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：

计算程序

①加人H2O2数

②加人H2O2mmol=①×0.08③底物浓度［S］=②÷4④酶作用后，KMnO4滴定ml

10.500.040.011.35

21.000.080.023.700.0370.043

31.500.120.036.400.0640.056

42.000.160.049.800.0980.062

52.500.200.0513.200.1320.068

⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/20.0135⑥回响速度V=②一⑤

0.0265

⑦[S]/V=③÷⑥0.3770.4650.5360.6450.735

按前述方法作图求得Km＝0.032mol/L。

l．Km值的意义是什么？

2．测酶Km值的测验中，需要更加留神哪些操作？

篇三：酶工程测验(2022.3)

测验一过氧化氢酶米氏常数的测定

一、目的

了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。

二、测验原理

H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性

环境中滴定，根据回响前后H2O2的浓度差可求出回响速度。

本测验以马铃薯供给过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km

三、测验器材

1.锥形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.温度计（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、测验试剂

1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）

取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml,即得。

2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。

3、0.02mol/LKMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。

4、0.004mol/LKMnO4：切实称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml

浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，持续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的切实浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml参与1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻

度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其切实浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25%H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。

6、25%H2SO4

五、操作

取锥形瓶6只，按下表依次参与试剂：

表一过氧化氢酶米氏常数的测定

先加好0.05mol/LH2O2及蒸馏水，加酶液后立刻混合，依次记录各瓶的起始回响时间。各瓶时间达5min时立刻加2.0ml25%硫酸终止回响，充分混匀。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。

六、计算

分别求出各瓶的底物浓度[S]和回响速度v。

[S]=c1V1/10

式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；

c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；

V1：H2O2体积（ml）；

10：回响的总体积（ml）；

υ：回响速度（mmol/min）；

c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；

V2：KMnO4体积（ml）；

以1/υ对1/[S]作图求出Km。

测验二酶促回响中初速度时间范围测定

一、测验目的

1.了解酶促回响中初速度时间范围测定的根本原理；

2.掌管酶促回响中初速度时间范围的测定方法。

二、测验原理

酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。

酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收猛烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶回响的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。

要举行酶活力测定，首先要确定酶回响时间。而酶的回响时间理应在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶回响的最适条件下，采用每隔确定时间测定产物生成量，以酶回响时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着回响时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，回响速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

三、测验试剂与器材1.试剂

（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）

取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。

（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯

精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。

（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材

恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。

四、操作步骤

1.酸性磷酸酯