分析CGRP参与LHb对痛觉的调节作用,免疫学论文

分析CGRP参与LHb对痛觉的调节作用,免疫学论文降钙素基因相关肽是一种由37个氨基酸残基组成的神经肽,属于降钙素基因相关肽家族[1].它是和降钙素(Calcitonin,CT)在不同组织中由同一基因在进行基因重组后构成,在心脏和神经系统中主要转录表示出成CGRP,而在甲状腺主要转录表示出成CT.人类的CGRP有和两种分子形式,且都有生物活性.CGRP广泛存在于中枢和外周神经系统中,并通过激活细胞膜上的CGRP受体的结合位点进而激活腺苷酸环化酶,促使细胞内cAMP水平升高而产生多种生理作用,如感觉、心血管活动、运动、睡眠、呼吸、体温调节等[2-5].同时,利用免疫组织化学观察到在硬脑膜上有大量的CGRP免疫反响性的神经纤维存在[6].有研究表示清楚,侧脑室注射CGRP能明显抑制压力的感受性反射[7],表示清楚CGRP在大鼠侧脑室内具有镇痛作用.脊髓以上水平,在多个与痛觉密切相关的脑区内,如中脑导水管周围灰质(Periaqueductalgray,PAG)、中缝大核(Nucleusraphemagnus,NRM)、伏核(NAc)和杏仁核(Centralnucleusofamygdale,CeA)等都发现过CGRP及其受体[8-10].缰核(Habenularcomplexes,Hb)是在镇痛作用中非常重要的核团,存在于脊椎动物的背侧间脑,可分为内侧缰核(Medialhabenularcomplex,MHb)和外侧缰核(Lateralhabenularcomplex,LHb)[11-13],而且LHb是杏仁核、海马、视前区等边缘系统到中脑的枢纽.有关CGRP在LHb内对大鼠痛觉调节的影响国内外尚未见报道,因而本实验通过对大鼠的LHb微量注射CGRP,采用热板和压板测痛仪来测量大鼠对伤害性热刺激和机械刺激所引起的HWL,并将其作为衡量大鼠痛觉的指标,进而分析CGRP介入LHb对痛觉的调节作用,能够为揭示CGRP在脊髓水平以上的中枢神经系统内镇痛作用的机制提供新的位点,并为CGRP受体冲动剂和拮抗剂的临床应用提供根据.1材料与方式方法1.1实验材料1.1.1动物实验动物选用成年雄性Wistar大鼠(由吉林大学白求恩医学院动物中心提供)8只,体重均在180~250g之间,实验期间分笼饲养,自然光照,自由饮水与进食,饲养温度16~24℃.1.1.2试剂与药品降钙素基因相关肽(上海强耀生物科技有限公司提供)用生理盐水配置成浓度为0.875、1.75、3.5和7nmol/l,10%水合氯醛,医用酒精,H2O2,亚甲基蓝,牙托粉和牙脱水等.1.1.3实验器材智能热板仪(YLS-6B),电子压痛仪(LYS-3E),均由安徽淮北正华生物仪器设备有限公司生产.手术器械、注射器、脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司生产).1.2实验方式方法1.2.1实验前期工作为了使大鼠熟悉测试环境,并减小实验误差,在实验开场之前需要对大鼠进行热板和压力测试训练.根据孙衍刚等[13]给出的实验方式方法,训练进行5d,天天5轮,每轮3次.经过训练后大鼠的HWL会维持在一个比拟稳定的范围,热板测试大约为3~5s之间,压力测试大约为5~7s之间.1.2.2核团微量注射用水合氯醛腹腔麻醉,将大鼠的头部水平固定在脑立体定位仪上,暴露头骨,参考Watson鼠图谱在外侧缰核定位,将不锈钢套管插入,用牙托粉和牙脱水固定,封住套管和颅骨之间的缝隙.手术后恢复2~3d后进行行为痛觉测试.进行核团微量注射前,将注射器插入套管,缓慢注射药物,每次注射后应让注射针在管里停留片刻再将之取出.1.2.3行为痛觉测试热板测试:热板的温度维持在52℃(51.7℃~52.3℃),将大鼠的待测后爪紧贴于热板上,并开场计时,待大鼠后爪感觉到疼痛,主动回缩离开热板时停止计时.记录注射CGRP和注射生理盐水对照组大鼠的HWL.压力测试:使用压力测痛仪对大鼠进行压力测试,用脚踩住开关,使小楔形有机玻璃压在鼠爪的跗跖关节处,待大鼠后爪感觉到疼痛时,会往回收缩,此时停止计时,记录注射CGRP和注射生理盐水对照组大鼠的HWL.1.3统计学数据处理实验所得的数据均以x-s形式表示,组间比照用独立样本t检验的方式方法进行统计处理.P0.05,P0.01,P0.001表示统计结果具有显著差异性.2结果2.1LHb内微量浓度为0.875、1.75、3.5和7nmol/l的CGRP的结果见表1~4.实验结果表示清楚,LHb内微量注射0.875nmol/lCGRP组与对照组相比大鼠左爪热刺激HWL有差异(P0.05),对大鼠右爪热刺激HWL有显著差异(P0.001),见表1;微量注射浓度为1.75、3.5和7nmol/lCGRP与对照组相比引起大鼠左、右爪热刺激HWL有显著性差异(P0.001),见表2~4.LHb内微量注射0.875nmol/lCGRP与对照组相比大鼠左爪机械刺激HWL有显著差异(P0.001),而对大鼠右爪机械刺激HWL无差异(P0.05)见表1;微量注射浓度为1.75、3.5和7nmol/lCGRP组与对照组相比引起大鼠左、右爪机械刺激HWL有显著性差异(P0.001),见表2~4.即LHb内微量注射CGRP能够引起明显的镇痛作用.2.2CGRP对正常大鼠的镇痛作用具有剂量依靠性,且在20min时镇痛效果最为明显,如此图1所示.3讨论当前应用于临床的镇痛药物多为吗啡、杜冷丁等阿片类药物,在让病人忘记疼痛的同时,也会产生耐药性以及成瘾性[14-16].因而,研究新型镇痛药物具有重要的生理学意义.而CGRP作为一种新型的神经肽,在体内分布广,功能多,并且能够避免阿片类药物的成瘾性等副作用,研究其在中枢水平的镇痛作用,在临床具有特别广阔的意义.本实验采用对大鼠LHb分别微量注射CGRP(用生理盐水配置)和生理盐水的方式方法,来讨论CGRP对大鼠痛觉的调节作用.结果表示清楚,注射CGRP组的大鼠与注射生理盐水组的大鼠相比,HWL明显增加,讲明CGRP在大鼠的LHb起到了镇痛作用,并且这种镇痛效果在20min左右最为明显,具有时间上的规律性.除此之外,有学者研究CGRP在大鼠扣带束及周围皮质对伤害性刺激反响的作用,结果表示清楚注射一定剂量的CGRP能显著降低大鼠对机械刺激的HWL,使大鼠对热板和机械压力刺激产生痛敏反响,同样有研究表示清楚,在脑内某些核团微量注射CGRP均能延长大鼠的HWL值,如中脑导水管周围灰质、侧脑室等[7,8,17].这是由于降钙素基因相关肽所在部位不同,与其不同受体结合导致的作用结果可能会不一样所致.在实验中还发现,对大鼠LHb微量注射4个不同浓度(0.875、1.75、3.5和7nmol/l)的CGRP作用效果不同,大鼠的后爪缩爪反响潜伏期也有显著差异.通过观察图表,能够得出结论,随着注射CGRP浓度的逐步增加,大鼠的HWL也逐步增加,讲明CGRP具有镇痛作用且具有剂量依靠性.根据不同的药理学特征,能够将CGRP受体分为两类,即CGRP1受体和CGRP2受体.有研究表示清楚,CGRP2受体可被CGRP所激动[3-8],但是对CGRP8-37的拮抗作用不明显;而相反的CGRP1受体对CGRP8-37的阻断效应较为敏感,但是高剂量的GGRP8-37可以以成为受体的冲动剂[17].同时,Bartho等[18]也发现CGRP受体的阻断剂CGRP8-37能够部分逆转由辣椒素所诱导的痛觉过敏及异常疼痛[19].但CGRP在LHb对大鼠的镇痛作用机制尚不特别清楚,有待于一步的讨论研究.以下为参考文献:[1]于龙川主编.神经生物学[M].北京:北京大学出版社,2020:141-147.[2]DobolyiA,IrwinS,MakaraG,etal.Calcitoningene-relatedpep-tide-containingpathwaysintheratforebrain[J].JCompNeurol,2005,489(1):92-199.[3]PoynerDR.Pharmacologyofreceptorsforcalcitoningene-relatedpeptideandamylin[J].TrendsPharmacolSci,1995,16:424-428.[4]王福庄,丁爱石,陈嘉,等.降钙素基因相关肽增加大鼠脑血流量[J].生理科学,1989,9(5):50-51.[5]SmithFL,WelchSP,DombrowskiDS,etal.Theroleofendoge-nousopioidsasmediatorsofthehypothermiceffectsofintrathecallyadministeredcalciumandcalcitoningene-relayedpeptidinmice[J].JPharmacolExpTher,1993,266:1407-1415.[6]SaurabhGuptal,DipakVasantraoAmrutkar,etal.EvidenceforCGRPre-uptakeinratduramaterencephali[J].BrJPharmacol,2018,8(161):1885-1898.[7]张继峰,唐朝枢.脑室内注射降钙素基因相关肽对压力感受性反射的抑制[J].中国应用生理学杂志,1995,12(3):280.[8]徐世莲.炎症大鼠中脑导水管周围灰质注射降钙素基因相关肽对痛觉的影响[J].昆明医学院学报,2006,27(2):23-27.[9]HuangYH,Brodda-JansenG,LundebergT,etal.Anti-nociceptiveeffectsofcalcitoningene-relatedpeptideinnucleusraphemagnusofrats:aneffectattenuatedbynaloxone[J].BrainRes,2000,873:54-59.[10]XuW,LundebergT,LiY,etal.Antinociceptioneffectofcalcito-ningene-relatedpeptideincentralnucleusofamygdale:activatingopioidreceptorsthoughamgdala-periaqueductalgraypathway[J].Neurosciecne,2003,118:1015-1022.[11]付立波,王学斌,刘凤莲.腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及c-fos蛋白表示出的影响[J].中国免疫学杂志,2018,26(2):141-145.[12]黄民,王绍,徐海燕.侧脑室注射腺苷对大鼠缰核痛神经元自发放电活动的影响[J].中国老年学杂志,2018,31(7):1186-1187.[13]孙衍刚,于龙川.甘丙肽介入痛觉调制的研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2004,10(4):108-110.[14]杨燕平,舒爱霞,付立波.白酒对老年性大鼠的镇痛作用[J].黑龙江畜牧兽医(科技版),2020,(3)138-139.[15]付立波.侧脑室注射淫羊藿苷对正常大鼠痛觉调节的影响[J].中国老年学杂志,2020,32(13):2775-2776.[16]王加真,张军.FacilitatingeffectsofCGRPorSPincingulumbundle/surroundingcortextissurinrats[J].中国神经科学杂志,2001,17(4):304-308.[17]