第四章 动物实验的设计和实施

第四章

动物实验的设计和实施一.动物实验设计的基本原则

1.相似性2.可靠性3.重复性

4.可控性5.经济性6.伦理性

二.动物实验课题的设计

1.实验动物选择

2.动物分组原则

三、动物实验的实施

1、实验动物的订购

2、动物实验基本方法

3、实验动物安死术

四.实验结果分析与外推生命科学研究的设计中遵循的原则

1.相似性(比较医学)

为了避免直接在人身上进行实验，必须在人为设计的条件下，选择动物作为人类的替代者。结论.无论何种动物均与人类不属同种生物。2.被判为对动物无效的药物，不等于临床无效。

设计的一个重要原则是：所获结果应尽可能类似于人类的情况。12.可靠性

课题研究结果要可靠，就要求使用的动物模型能够准确模拟人类的疾病，即可特异地，真实地反映某种疾病或机能、代谢、结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，经化验或X光照片，心电图，病理切片等证实。

要使实验结果可靠,就必须使用质量符合实验要求的实验动物。

如不合格的实验动物易自发地出现某些相应病变的症状，就不应选用。

为了确保实验动物在进行实验处理后的反应可靠性，还要求实验环境保持稳定，动物实验设施符合动物实验的需要，以及保障实验人员和环境免受实验危害。3.重复性

科学与实用、经典与创新

科学研究成果必须能够重复，所用动物模型应能重复培育，且能实现标准化。如用一次定量放血法可导致动物百分之百呈出血性休克，百分之百死亡，这就符合可重复和达到标准化的要求。但结扎犬冠状动脉的后果差异太大，不同犬同一动脉相同部位的结扎后果无法预测，不能标准化;

改用实验小鼠、大鼠、地鼠或豚鼠结扎冠状动脉，其结果就比较一致，可标准化。

用犬做心肌梗死模型应较合适，犬的冠状动脉循环与人相似，且适宜做暴露心脏的剖胸手术；4.可控性

对动物及其实验操作过程控制

在课题研究中使用的动物模型应考虑到今后临床应用和便于控制其疾病的发展，以利课题的顺利进展。

如雌激素能终止实验大鼠和小鼠的早期妊娠，但不能终止人的妊娠。

以实验大鼠或小鼠筛选带有雌激素活性的药物时，常发现这类药物能终止妊娠，似乎是有效的避孕药，但用于人类却不成功。如果已知待测药物含有雌激素，就不能使用实验大鼠或小鼠观察其终止妊娠的作用。

实验大鼠和小鼠对革兰氏阴性菌有较强的抵抗力，不宜选用实验大鼠或小鼠作实验性腹膜炎动物模型，不容易导致腹膜炎。

有的动物对某些致病因子特别敏感，很难控制，极易死亡，不适宜研究

...

,.如犬腹腔注射粪便滤液引起腹膜炎，有80％在24h内死亡；等不及实验治疗观察；且粪便滤液中细菌菌株难于控制，不能准确重复实验结果。5.经济性

经费预算和其他考虑

在设计和执行课题计划时，对选用的动物和采用的方法应符合课题经费预算。

灵长类实验动物与人类最相似，但其数量少，价格贵，不宜多用。目前已有为数众多的实验小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠能复制成十分近似人类疾病的动物模型。其年龄、性别、体重等可根据课题需要而选择，

价格比灵长类动物低，便于饲养管理和实验操作，可按需使用。6.动物实验的福利与伦理

使用合格的实验动物，以减少使用数量。

根据动物的习性，给予适当的居住空间，进行科学的饲养管理。

使用适当的麻药，减轻动物紧张，最后对动物采用安死术。

尽可能采用“替代”，包括生命系统和非生命系统的替代。

实验动物的福利与伦理随着世界上动物保护主义的兴起，而医学生命科学研究又不得不使用实验动物的前提下产生的。因此，1959年Russell和Burch发表的《仁慈的试验技术原理》一书中提出的动物实验应采取替代、减少和优化原则（即“3R”）被广大生命科学工作者所接受。1.替代（replacement）原则：是指在试验系统中尽可能用低等实验动物替代高等实验动物，用离体培养的细胞、组织、器官替代动物个体，用微生物替代动物，用物理、化学等非生命系统替代生命系统的实验，并能获得相同试验结果的科学方法。2.减少（reduction）原则：是指如果某一研究方案中必须使用实验动物，同时又没有可行的替代方法，则应通过合理的实验设计，把使用动物的数量降低到实现科研目的最小量，或用较少的动物获得更多的实验数据，或者综合利用动物。3优化（refinement）原则：是指通过改善动物设施、饲养管理和实验条件，精选实验动物、技术路线和实验手段，优化实验设计和实验操作技术，熟练掌握动物实验方法，尽量减少实验过程中对动物机体的损伤，减轻动物遭受的痛苦和应激反应，使动物实验得出科学的结果。违背伦理

把小狗小猫放入微波加热装置中，以研究微波加热引起的伤害与一般发热引起伤害的差别，结果使这些动物在数十分钟内极其痛苦地死亡。

其他一些实验手段，如“砸碎”、“冷冻”、“出血”、“压力或应激”、“脊髓损伤”、“剥夺蛋白质”等都属于违背伦理的操作。

在饲养管理和使用实验动物过程中，要采取有效措施，使实验动物免遭不必要的伤害、饥渴、不适、惊恐、折磨、疾病和疼痛，保证动物能够实现自然行为，受到良好的管理和照料，为其提供清洁、舒适的生活环境，提供充足的保证健康的食物、饮水，避免或减轻疼痛和痛苦等。

化妆品公司为了观察洗发香波的毒性，把它滴入兔眼，持续三周观察兔眼的溃烂情况。兔会发出惨痛的嘶叫，拼命抓眼，最后双目失明。二.动物实验课题的设计(一)实验动物选择

在生命科学和医学的研究中，通常以动物作为实验对象，但由于不同种动物具有不同生物学特性，即使同品种不同亚系间也存在一定的差异，必须根据动物实验课题的要求和目的选择合适的动物。1.选择的基本原则1）根据实验目的选择动物2)选择在结构、机能、代谢以及发病机理与人相似的实验动物3)选用解剖、生理上有特点的动物4)选用特殊生理反应的动物以符合不同的实验要求

(1)根据实验目的选择动物

按照实验目的和要求选用合适的实验动物，是保证实验研究成功的关键。

各种实验动物均具有各自生物学特点，只要选择恰当，妥善使用，将能简化实验操作，使实验易于成功。如：犬的甲状旁腺位于两个甲状腺端部的表面，位置比较固定.作甲状旁腺摘除实验，应选犬而不用兔。兔的甲状旁腺分布的比较散，位置不固定。甲状腺摘除实验要保留甲状旁腺的功能，就要选兔不选犬。

猪是二十世纪才开发的实验动物。

猪的皮肤在结构上与人皮肤有很多相似点，经处理后的猪皮片，常被用作严重烧伤病人的过度性皮肤。猪的心血管系统与人类也较为接近，尤其是小型猪的开发成功，为猪的大规模实验提供了有利条件两栖类动物，如蛙类,其大脑很不发达，但脊髓的发展已符合实验要求，达到简单、直观、明确、容易分析结果。(2)选择在结构、机能、代谢以及发病机理与人相似的实验动物

生物医学领域的研究，绝大多数是利用实验动物的某些与人类相近似的特性，通过动物实验，了解人类疾病的发生、发展过程，以利解决疾病的预防和治疗。

通常实验动物愈高等,进化愈完善,其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈近似于人类。

灵长类动物与人在分类学上地位最相近，是研究人类多种疾病的理想动物；是牙科学，胚胎学，病理学，解剖学，生理学，免疫学等多种学科的常用动物；也是研究人类生殖课题的首选动物。如猕猴，其生殖生理与人类非常接近，月经周期为28d，是研究人类生殖生理的理想动物。

很多传染性疾病，有较强感染种属特异性，如人类乙型肝炎病毒（HBV），在自然情况下只感染人和黑猩猩。灵长类实验动物价格昂贵，饲育要求高，目前至少有66种灵长类动物被列入濒危保护动物。若要广泛地，大量地使用尚有困难。尤其是黑猩猩等，不但数量有限、实验操作麻烦；还是濒危保护动物。动物进化程度越高并不是所有器官和功能都越接近人类

如犬有发达的血液循环和神经系统，以及与人基本相似的消化过程，在毒理学方面的反应与人类比较接近。猫可以耐受麻醉与脑的部分破坏术，其反应机能与人相似。猪的皮肤组织学结构与人相似；猪的心脏瓣膜可以直接植入人体，以修补人的心脏瓣膜之缺陷

近年来，国内实验室研究血脂代谢常用大鼠和小鼠；然而，已有许多证据表明，大鼠和小鼠血清脂蛋白的构成和体内脂质代谢过程与人类相距甚远，不能真实反映人类脂代谢状态。国际上高脂血症动物模型趋向于豚鼠和金黄地鼠。脂蛋白在循环血液中存在形式（%）低密度脂蛋白高密度脂蛋白极低密度脂蛋白低密度/高密度人类6030102豚鼠7020103.5兔4050100.8地鼠395650.7小鼠167860.21大鼠1080100.13(3)选用解剖生理上有特点的动物

外科实验,通常选用体形稍大的、耐受力较强的动物，如大鼠、犬等动物。这将对实验的成功起着重要的作用。

如：兔颈部的交感神经、迷走神经和减压神经是单独平行分布人、犬、猫、猪等减压神经是分布在交感神经和迷走神经之间,且不易分开；

选用兔观察减压神经对心脏影响较为合适。

大鼠没有胆囊，不适合作胆囊功能的研究，适合作胆道插管和收集胆汁实验。

大鼠、小鼠的性成熟期早，性周期和妊娠期短，产仔数多，生命周期短，适用于避孕药物、营养学、毒理、胚胎学和致畸等方面的研究。兔耳的动脉和静脉都较明显，如需反复药物注射和耳静脉采血,实验兔是较为理想的选择。兔和猫是典型的刺激性排卵动物，成年母兔常被作为诱发排卵观察和避孕药物的研究。青紫蓝兔的后肢腘部和腹沟股处的淋巴结较明显，通常在体表即可触及到，适合于作淋巴结内注射的免疫性研究。

约有80%的沙鼠左右两侧大脑血管不相交通；

且排尿量和饮水量极少；适合于作脑血管疾病和肾功能的研究。(4)选用特殊生理反应的动物以符合不同的实验要求

鸽、犬、猴和猫的呕吐反射十分灵敏，适合于作呕吐反射试验；

而啮齿类动物，尤其是大鼠、小鼠则基本没有呕吐反射，故需灌胃的实验选择大鼠、小鼠为合适。

兔的体温变化十分灵敏，适合作热源试验。鼠、小鼠体温调节差，不适合作致热源试验。豚鼠体内缺乏合成维生素C酶,只能从饲料中得以补充。维生素C缺乏1个月后,会出现坏血病当的临床症状，一旦给予补充则症状消失。2.动物选择的一般规律(1)选择标准化的实验动物

(2)年龄和体重

(3)性别

(4)生理状况

(5)健康状况

(6)品种、品系

(7)多种动物联合使用

(1)选择标准化的实验动物

标准化的实验动物是指遗传背景清楚，微生物学和寄生虫学质量得到控制，饲养环境及其饲料营养均符合国家标准的动物。

切忌随意使用来源不清的实验动物，进行动物实验。

应根据研究的目的要求，选用符合实验动物国家标准的实验动物。

在微生物学方面，应选用清洁级、无特定病原体动物，或无菌动物等如在遗传学方面可选用近交系、封闭群、突变系或杂交F1动物。大、中型实验动物，如兔、犬、猴等，也应选择无人兽共患疾病和遗传背景清楚的普通级动物。不同微生物学等级的

实验动物比较项目GFSPFCV传染病无无有或可能有寄生虫无很少有或可能有实验结果准确较准确有疑问应用动物数少量少量多或大量长期实验效果可能好可能好困难死亡率很低低高长期实验存活率约100％约90％40％左右实验标准设计可能可能不可能统计价值很好较好不准确实验结果的价值很高高有疑问(2)年龄和体重

在毒理或感染等实验中，幼龄动物较成年动物敏感；因此，通常选用成年鼠。

在饲育环境和饲料营养均达标的条件下，实验动物的年龄与体重，基本上成正比。若发现动物个体间体重超过10％，则该群（组）动物自身存在差异，不宜用作实验(3)性别

同品种或同品系的不同性别动物，对同一实验的反应有差异。

雌性动物易受性周期、怀孕、哺乳等影响。

通常采用雌雄各半的原则；

。（4）生理状况雌性动物在妊娠期和哺乳期,以及动物换毛季节等不适宜作实验。

（5）健康状况实验动物患病时，不可进行实验，若是大动物，待其康复后再考虑是否使用；若是小动物予以淘汰。(6)品种、品系

不同品种和品系的实验动物，具有不同的生物学特性，对相同试验会出现不同的反应结果。

如果实验需要的是近交系动物，而误用了非近交系动物，实验将不可能成功。

常用的BALB/c小鼠，已有不少亚系，在不同实验室制备的鼠原性单克隆抗体的效价差异就很大。

C3H、AKR、NZB、NZW、SHR等均是良好的模型动物，具相应的适用范围，若有选错，实验结果将会令人费解。(7)多种动物联合使用

实验中使用一种动物所获得的结果总是有限的，同时使用2种，或2种以上的动物所得的实验结果更有利于作出正确的判断。

在新药的临床前研究中，就规定必须使用一种啮齿类动物（大鼠），另一种大型动物（犬或猴或小型猪）。(二)动物实验分组原则

在研究中，对实验动物的分组应按照机遇均等的原则进行，即随机性原则。

目的是尽量减少干扰因素造成的实验误差，不受实验人员主观因素，或其它偏性误差的影响。

随机化的手段可采用编号卡片抽签法,随机数字表或采用计算机的随机数字键进行。设对照组的问题在动物实验中准确设立对照组非常重要，常有忽视或错误设立对照组的情况，导致了实验失败。对照方法1.空白对照是在不给任何措施的情况下观察动物自发变化的规律。2.实验对照是采用与实验组相同操作条件的对照。3.有效对照在药物研究中，用已知有效药物作对照，考核方法可靠性和新药的有效性。4.配对对照自身对照。（实验前后或身体两侧5.交叉对照对照组作为实验组的重复。6.实验重复和肯定即多种动物的联合使用7历史对照与正常值对照必须非常慎重，否则将会得出不恰当甚至错误结论。1、实验动物的订购2、动物实验基本方法3、实验动物安死术

三、动物实验的实施1.实验动物订购必须向具有实验动物生产许可证的单位订购符合实验要求的实验动物实验动物在运输过程中，必须符合相应的微生物学等级要求。普通级实验动物购入后，必须进行健康检查和隔离检疫，才能用于实验。

不同运输时间对大鼠体重的影响运输时间h运输前体重g运输后体重g体重变化g100%*体重变化/运输前体重0.5254.56±8.51247.70±7.686.86±1.582.69±0.591.0255.14±11.32246.93±11.148.20±1.213.22±0.471.5255.22±13.26244.25±13.0210.98±1.944.30±0.74对照254.30±9.21252.20±9.212.10±0.730.83±0.29大鼠运输后血糖和白细胞的测定结果分组

血糖mmol·L-1WBC109·L-1运输时间h恢复时间h0.506.72±0.309.18±1.581.006.86±0.429,29±1.301.505.40±0.569.33±1.101.5247.24±0.4414.42±2.161.5486.50±0.3914.66±1.801.5726.45±0.3417.40±2.161.5966.52±0.3217.00±1.77对照-6.33±0.3816.25±1.282023/2/4华东师范大学41（1）实验动物的保定（2）动物标记和除毛法（3）给药途径和方法

（4）麻醉和采血技术2、动物实验基本方法（1）实验动物保定

应以不使动物产生痛苦、符合生理特性、减少应激、便于实验操作为原则。动作轻缓忌动作突然用力过猛避免抓耳朵呼得应，抱着走避免惊吓动物2023/2/4华东师范大学43笼号项圈针刺耳记耳环（牌）芯片

生物染色剂（如：苦味酸的80-90%酒精饱和溶液、碱性品红、甲基兰等）

（2）实验动物标记实验动物除毛法（剪毛，拔毛，脱毛。剃毛）

标记号码清楚、持实验动物除毛法久、简便、易认和耐久适用。挂牌剪趾剪毛2023/2/4华东师范大学44（3）实验动物给药方法动物自动摄入（加样饲料匀质化掺入待测物质对饲料营养平衡的干扰饲料中待测物质与其他成分间可能产生的相互作用）2.灌胃3.注射给药注射给药的方法

A.皮内注射B.皮下注射C.肌肉注射D.腹腔注射

E.静脉注射F.脑内接种

G.其他接种法A.皮内注射对实验兔和豚鼠,常以其背部或腹部为皮内注射部位。如欲观察动物的皮肤反应,宜选择白化的动物或局部为白色处接种。B.皮下注射的部位小鼠的背部;大鼠的背部或侧下腹部;猫，犬的大腿外侧皮下兔在背部或耳根部;豚鼠的大腿内侧,或小腹部等脂肪少的部位;C.肌肉注射对实验动物肌肉注射,通常选用的部位为:后肢的股二头肌和臀部肌肉。注射时应避开骨质结构、神经和血管D.腹腔注射

注射时沿腹白线右侧向左侧约呈450角度进针，应避开肝脏、脾脏、肾脏、胃、大小肠、腹膜等脏器，预防药液返流E.

静脉注射对家兔静脉注射,通常在其耳缘静脉。因一次注射后，注射部位的血管常常形成拴塞，妨碍血液通流，如欲多次注射，应先自耳尖部之血管开始注射，逐次下移。F脑内接种多在微生物学动物实验时应用。常用动物为实验小鼠；实验兔和豚鼠由于颅骨较硬，需用穿颅钢锥穿透颅骨，再用注射器针头刺入脑内。

注射速度一定要慢，避免引起颅内压急速升高。.G其他接种法某些科研工作中,也需将接种物划痕接种于实验动物的皮肤上;吸入鼻腔;接种于气管；接种于眼内或睾丸内.做角膜划痕接种或鼻腔接种常需对动物进行局部麻醉(5％可卡因)或乙醚轻度麻醉。不同种类实验动物不同给药方法一次给药能耐受的最大容量mL(四).采血和麻醉技术

采血方法的选择，取决于实验目的和所需要血量以及动物种类。

如欲获取全血，血浆或血球，采血后可注入含抗凝剂的容器内,或盛有玻璃珠的试管或玻瓶内;

如欲得清晰的血清，可于早晨未饲喂前采血。采集实验动物血液的方法采血量采血部位动物种类少量血尾静脉大鼠、小鼠眶静脉丛兔、大鼠、小鼠耳静脉兔、犬、猫、猪、山羊、绵羊中量血心脏大鼠、小鼠耳中央动脉、耳静脉豚鼠、大鼠、小鼠足背中央静脉兔颈静脉豚鼠前肢内侧皮下头静脉兔、犬、猫后肢内侧皮下小隐静脉犬、猫、猴大量血腋下静脉大鼠、小鼠股动脉、颈动脉兔、犬、猫、猴颈静脉马、牛、山羊、绵羊心脏兔、犬、猫、猴实验动物采血量（ml）动物种类最大安全采血量最小致死采血量小鼠0.10.3大鼠12豚鼠510兔1040犬50300猴1560(四）、动物麻醉的方法

包括全身麻醉、局部麻醉、针刺麻醉、复合麻醉、低温麻醉等，一般实验常选择全身麻醉。

.全身麻醉前的准备麻醉药物与器械的准备。准确计算麻醉药物的剂量。麻醉中毒解救药物的准备。麻醉前禁食：

对大多数哺乳类实验动物和鸟类动物，10∼12h。反刍类动物中，大体型的成年动物，麻醉前空腹时间达36∼48h。.全身麻醉的方法A、吸入麻醉

吸入麻醉的方法是用挥发性麻醉剂或气体麻醉剂使动物吸入体内，达到麻醉的效果。挥发性麻醉剂常用的有：乙醚、氯仿、氟脘、异氟脘等。气体麻醉剂常用有环丙烷、氧化亚氮等；是啮齿类实验动物常用的麻醉方法B、非吸入麻醉

通常采用的是注射方法，可经静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等达到麻醉的效果。常用的麻醉药有戊巴比妥钠、硫喷妥钠、水合氯醛、盐酸氯胺酮等，注射方法和剂量可查表。种类戊巴比妥硫喷妥钠盐酸氯氨酮水合氯醛乌拉坦Mg/kg途径Mg/kg途径Mg/kg途径Mg/kg途径Mg/kg途径小鼠35I.V.25I.V.----50I.P.50I.P.22~44I.M.400I.P.大鼠25I.V.20I.V.----50I.P.40I.P.22~44I.M.300I.P.0.75I.P.豚鼠30I.V.20I.V.----40I.P.55I.P.22~44I.M.200~300I.P.1.50I.P.家兔30I.V.--------40I.P.20I.P.22~44I.M.1.0I.V.仓鼠20I.V.--------35I.P.40I.P.----200~300I.P.猪20~30I.V.9~10I.V.10~15I.M.15I.V.5I.V.10~15I.M.猴35I.V.25I.V.----60I.P.15~40I.M.----犬30I.V.25I.V.----125I.V.1.0I.V.猫25I.V.28I.V.15~30I.M.300I.V.1.25~1.50I.V.羊30I.V.--------实验动物常用麻醉药的剂量和注射途径注：I.V.为静脉内注射；I.P.为腹膜内注射；I.M.为肌肉注射；S.C.为皮下注射C.局部麻醉

0.5∼1%盐酸普鲁卡因，是无刺激性的快速局部麻醉剂；对皮肤和黏膜的穿透力较弱，需注射给药才能产生局麻作用。注射后1∼3min内产生麻醉，可维持30∼45min。

丁卡因的局麻作用比普鲁卡因强10倍，动物吸收后的毒性作用也相应加强，能穿透黏膜，作用迅速，1∼3min生效，持续60∼90min。

利多卡因常用于表面、浸润、传导麻醉和硬脊膜外腔麻醉。作用效力和穿透力均比普鲁卡因强两倍，作用时间也较长。常用浓度为0.