实验六DNA的体外连接

实验五、DNA的体外连接学习DNA片段之间的体外连接方法一、实验目的二、实验原理DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4DNA连接酶的底物可为：(1)一条链带有缺口的双链DNA分子；(2)两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3)两个存在平末端的DNA片段；(4)RNA－DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。T4DNA连接酶催化DNA连接的反应分三步进行：(1)辅助因子ATP中磷酸基团与T4DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物；(2)酶-AMP复合物活化DNA链5’端的磷酸基团，形成磷酸－磷酸酯键；(3)DNA链3’端的羟基活化与5’端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DNA链间的连接。用于克隆的质粒载体在用单酶切酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。四、仪器设备五、实验用具电泳仪

微型电泳槽

紫外透射检测仪

恒温金属浴冰箱冰盒微量离心管移液器微量离心管（1.5ml、0.5ml）

吸管头若干三、实验材料上次实验课回收的MP3酶切片段，用试剂盒抽提的pSK质粒六、试剂

琼脂糖0.5TBE电泳缓冲液

10载样缓冲液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色剂（10000，Solarbio）DNA分子量标准（DNAmarker）：MarkerIII（广州东盛生物科技有限公司）已知系列浓度的λDNA(10、20、50、100ng/l)（TaKaRa）牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinealkalinephosphatase,CIAP,TaKaRa）T4DNA连接酶（T4DNAligase,TaKaRa）DNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）七、实验步骤1、pSK载体的HindIII酶切2、HindIII酶切pSK载体的脱磷3、脱磷pSK载体的回收4、目的片段和载体的定量5、目的片段和载体的连接6、准备感受态细胞制备和大肠杆菌转化用试剂和用品1、pSK载体的HindIII酶切100l反应体系（1.5ml离心管）：

pSK质粒DNA

500ng（试剂盒抽提）酶切Buffer

10

l

Hind

III酶1

l灭菌ddH2O

upto

100l加样顺序：水、buffer、DNA、酶37℃恒温箱酶切30min。

2、HindIII酶切pSK载体的脱磷在上述100l酶切体系中加入：

10×CIAPbuffer

5l

稀释10倍的CIAP酶1l（3U）37℃恒温箱消化30min。注：浓度高的酶可以用水和反应buffer进行稀释，稀释后的酶液应在1×的buffer里；稀释的酶先用现配，用后弃去。100l稀释体系（1.5ml离心管）：灭菌ddH2O

80lCIAPBuffer

10

l

CIAP酶10

l加样顺序：水、buffer、酶，轻柔混匀后短暂离心收集到管底备用。3、脱磷pSK载体的回收在上述脱磷体系中加入ddH2O调整体积到200l，然后加入等体积的BD溶液，然后利用DNA凝胶回收试剂盒从步骤5开始进行回收，最后用30l的Eluent进行洗脱。利用琼脂糖凝胶（1%）电泳法检测DNA浓度：分别取回收的MP3酶切片段、酶切和脱磷的pSK质粒、已知浓度的λDNA各1l于点样板小孔中，再加入8lTE和1l的10载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5lMarkerⅢ作为分子量标准。电泳后的目的片段和载体条带的亮度与已知浓度的λDNA的亮度进行比较，估算出其浓度。4、目的片段和载体的琼脂糖凝胶电泳定量4、目的片段和pSK载体的连接（每组同时做2个载体自连对照）10l反应体系（0.5ml离心管）：酶切的pSK质粒DNA

10-20ngMP3酶切回收片段10-20ng10×T4DNA连接酶Buffer

1

l稀释10倍的T4DNA连接酶1

l（35U）灭菌ddH2O

upto

10lddH2O、pSK质粒DNA和MP3酶切片段混匀后先在45度热板上温育5min使粘性末端分开，之后加入T4DNA连接酶buffer和T4DNA连接酶，混匀，稍离心后放于4℃冰箱中连接到下次实验。T4DNA连接酶Weiss单位：连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现在也称为ppi单位。0.01个Weiss单位能在16℃，30min内将HindIII完全酶切的1ug

DNA片段完全连接。（粘性末端）1个Weiss单位在16℃，30min内能将HaeIII完全酶切的1ug

DNA片段完全连接。（平末端）DNA分子连接带有相同粘性末端的载体和外源DNA片段，在连接反应中外源片段和载体DNA均可发生自身环化或几个分子串联形成寡聚物，而且正反两种连接方向都有可能。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5’-磷酸基团用碱性磷酸酶去掉，最大限度的抑制质粒DNA的自身环化。带5’端磷酸的外源DNA片段可以有效的与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入大肠杆菌受体菌后的扩增过程中，缺口可自动修复。注意事项1、克隆用的载体质粒要求较高纯度，使之能用最少的酶和较短的反应时间达到完全的切断。使用过量的内切酶或CIP以及过长时间的反应会使载体末端缺失，产生大量的假阳性菌落（白色但没有插入子）。2、使用T4DNA连接酶之前，应看清楚生产厂家所使用的活性定义单位，以便采用合适的酶浓度反应条件，不致造成不必要的浪费。3、目的DNA片段与载体DNA之间的摩尔浓度